流体切应力对肝再生影响及其信号通路研究

发布时间：2018-04-23 05:24

本文选题：肝再生 + 流体切应力　；参考：《昆明医科大学》2016年硕士论文

【摘要】：研究背景肝脏参与了人体许多重要的生理活动(代谢、解毒、免疫吞噬等),肝细胞是其完成这些生理活动的结构基础。肝再生能力十分强大,在行部分肝叶切除术或者发生重症肝炎时,肝细胞发生增殖反应,使其质量/体积恢复大致如常,以满足机体正常生理功能的需求。探索肝再生的机制十分重要。目前,有关肝再生机制的研究有生物化学学说和生物力学学说两种：前者如HGF、TGF等多种化学因子介导的生物化学信号途径促进肝细胞的增殖的研究已较为深入；而后者研究相对较少,临床和实验研究发现,门静脉血流动力学的变化对肝再生也有重要的影响,但是尚未见到生物力学因素对肝细胞增殖影响的相关研究。其它组织相关的生物力学研究发现,生物力学信号可通过FAK受体介导影响细胞的增殖反应,FAK还通过"Crosstalk"与生长因子受体通路相互作用,共同影响细胞的增殖。我们前期的研究结果显示,门静脉血流力学变化与FAK的表达以及肝再生之间存在密切的关系,血流力学可能通过FAK介导“细胞外基质配体-整合素-细胞骨架”的信号通路来调节肝细胞的增殖。在此前提下,改变细胞生存的力学环境,是否改变肝细胞增殖的动力学尚不清楚。同样在力学作用下,肝细胞的增殖反应是否发生了相应信号分子表达的变化尚不清楚。本课题拟就力学作用下肝细胞的增殖反应和相关力学信号传导通路的调节作用进行研究。研究目的本实验分为两个部分：第一部分切应力对肝细胞增殖的影响：以永生化大鼠3RL-3A肝细胞株为研究对象,加载不同大小的流体切应力(Odyn/cm2-30 dyn/cm2),通过对细胞增殖动力学的观察来研究流体切应力对肝细胞增殖的影响。第二部分切应力通过活化Ras/MAPK信号通路关键蛋白ERK1/2促进肝细胞增殖的研究：以永生化大鼠BRL-3A肝细胞株为研究对象,在加载一定大小的切应力下,同时用ERK1/2抑制剂抑制Ras/MAPK信号通路,通过观察细胞的增殖情况及检测Cyclin D蛋白表达水平及基因表达水平,来研究在肝细胞增殖过程中切应力与Ras/MAPK信号通路的关系。研究方法(一)流体切应力对肝细胞增殖影响的研究：1.研究对象：永生化大鼠BRL-3A肝细胞株；2.细胞的培养及流体切应力的加载；3.实验分组：1)对照组(B0组)：不予记载切应(B-Odyn/cm2)；2)加12 dyn/cm2组(B12组)：对培养的细胞施加12 dyn/cm2切应力(B-12dyn/cm2)；3)加24 dyn/cm2组(B24组)：对培养的细胞施加24 dyn/cm2切应力(B-24dyn/cm2)；4.采用直接细胞计数和CCK-8检测细胞增殖情况。5.对实验结果进行t检验统计学分析。(二)切应力通过活化Ras/MAPK信号通路关键蛋白ERK1/2促进肝细胞增殖的研究研究对象：永生化大鼠BRL-3A肝细胞株；1.ERK1/2的特异性抑制剂PD98059处理干预组细胞2.细胞的培养及流体切应力的加载；3.实验分组：1)对照组：将细胞玻片置入流体应力加载系统相同时间但不对其加力,也不给予抑制剂处理；2)单纯加压组：仅给细胞分别加载24dyn/cm2大小的流体切应力；3)干预组：在给细胞加载24dyn/cm2大小的流体切应力的同时在预先用ERK1/2蛋白抑制剂PD98059处理；4. 采用直接细胞计数和CCK-8检测细胞增殖情况；5. Western印迹分析和荧光定量PCR检测；6.对实验结果进行t检验统计学分析。实验结果(一)流体切应力对肝细胞增殖影响的研究1.永生化大鼠BRL-3A肝细胞直接细胞计数结果：1)对照组(B0组)：0-168小时区间对照组细胞数呈加趋势,于0-24小时内增加最快。2)加12 dyn/cm2组(B12组)：0-24小时区间B12组细胞数呈增加趋势,于24小时达到增殖高峰,并于24-168小时细胞增殖速率下降。3)加24 dyn/cm2组(B24组)：0-24小时区间B24组细胞呈增加趋势,于24小时达到增殖高峰,并于24-168小时细胞增殖速率下降。4)加12 dyn/cm2组(B12组)与对照组(B0组)：同一时间位点,B12组细胞数明显大于B12组细胞数(P0.05)。5)加24dyn/cm2组(B24组)与对照组(Bo组)：同一时间位点,B24组细胞数明显大于B0组细胞数(P0.05)。6)加12 dyn/cm2组(B12组)与加24 dyn/cm2组(B24组)：同一时间位点,B24组细胞数明显大于B12组细胞数(P0.05)。2.永生化大鼠BRL-3A肝细胞CCK-8吸光度值检测结果：1)对照组(B0组)：0-168小时区间对照组细胞呈增殖趋势,于0-24小时内增加最快。2)加12 dyn/cm2组(B12组)：0-24小时区间B12组细胞吸光度值呈加趋势,于24h达到高峰,并于24-168h出现吸光度值下降。3)加24 dyn/cm2组(B24组)：0-24小时区间B24组细胞吸光度值呈加趋势,于24h达到高峰,并于24-168h出现吸光度下降。4)加12 dyn/cm2组(B12组)与对照组(Bo组)：同一时间位点,B12组细胞吸光度值明显大于B0组细胞吸光度值(P0.05)。.5)加24 dyn/cm2组(B24组)与对照组(Bo组)：同一时间位点,B24组细胞吸光度值明显大于B0组细胞吸光度值(P0.05)。6)加12 dyn/cm2组(B12组)与加24 dyn/cm2组(B24组)：同一时间位点,B24组细胞吸光度值明显大于B12组细胞吸光度值(P0.05)。(二)切应力通过活化Ras/MAPK信号通路关键蛋白ERK1/2促进肝细胞增殖的研究1.永生化大鼠BRL-3A肝细胞直接显微镜下细胞计数结果：1)对照组(A组)：0-168小时区间A组细胞数呈增加趋势,于0-24小时内增殖最快。2)加压组(B组)：0-24小时区间B组细胞数呈增加趋势,于24小时达到增殖高峰,并于24-168小时细胞增殖速率下降。3)干预组(C组)：0-24小时区间C组细胞数呈增加趋势,于24小时达到增殖高峰,并于24-168小时出现细胞增殖速率下降。4)加压组(B组)组与对照组(A组)：同一时间位点,B组细胞数明显大于A组细胞数(P0.05)。5)加压组(B组)组与干预组(C组)：同一时间位点,B组细胞数明显大于C组细胞数(P0.05)。6)干预组(C组)与对照组(A组)：同一时间位点,C组细胞数略大于A组细胞数(P0.05)。2.永生化大鼠BRL-3A肝细胞CCK-8吸光度值检测结果：1)对照组(A组)：0-168小时区间A组吸光度呈增加趋势,于0-24小时内增加最快。2)加压组(B组)：0-24小时区间B组吸光度呈增加趋势,于24小时达到高峰,并于24-168小时出现下降。3)干预组(C组)：0-24小时区间C组吸光度呈增加趋势,于24小时达到高峰,并于24-168小时出现下降。4)加压组(B组)组与对照组(A组)：同一时间位点,B组吸光度明显大于A组吸光度值(P0.05)。5)加压组(B组)组与干预组(C组)：同一时间位点,B组吸光度明显大于C组吸光度值(P0.05)。6)干预组(C组)与对照组(A组)：同一时间位点,C组细胞吸光度大于A组吸光度值(P0.05)3. Westen blot检测永生化大鼠BRL-3A肝细胞ERK1/2的蛋白表达水平：1)加压组(B组)组与对照组(A组)：在24小时时,B组Cyclin D1与β-Actin蛋白条带灰度值的比值明显大于A组(P0.05)。2)加压组(B组)组与干预组(C组)：在24小时时,B组Cyclin D1与 β-Actin蛋白条带灰度值的比值明显大于C组(P0.05)。3)干预组(C组)与对照组(A组)：在24小时时,C组Cyclin D1与β-Actin蛋白条带灰度值的比值大于A组(P0.05)。4.PCR检测永生化大鼠BRL-3A肝细胞ERK1/2的基因水平表达的：1)加压组(B组)与对照组(A组)：在24小时时,B组mRNA表达量明显大于A组(P0.05)。2)加压组(B组)与干预组(C组)：在24小时时,B组mRNA表达量明显大于C组(P0.05)。3)干预组(C组)与对照组(A组)：在24小时时,C组mRNA表达量大于A组(P0.05)。全文结论(一)永生化大鼠]3RL-3A肝细胞株,加载切应力组肝细胞增殖明显大于对照组；加载切应力大组增殖明显大于加载切应力小组和对照组。说明切应力对永生化大鼠BRL-3A肝细胞株的增殖有促进作用；在生理可承受范围内(0dyn/cm2-30 dyn/cm2)受切应力大者增殖速率明显大于受切应力小者。(二)永生化大鼠BRL-3A肝细胞株,抑制Ras/MAPK信号通路能降低切应力促进肝细胞增殖的速度；但不能完全抑制切应力对肝细胞增殖的促进作用。说明切应力促进肝细胞增殖与激活Ras/MAPK信号通路有关；Ras/MAPK信号通路并非切应力促进肝细胞增殖的唯一通路。
[Abstract]:The research background liver is involved in many important physiological activities of human body ( metabolism , detoxification , immune phagocytosis , etc . ) . The liver cell is the structural basis for the completion of these physiological activities . The liver regeneration ability is very strong . It is very important to explore the mechanism of liver regeneration .
In this study , the effects of fluid shear stress on the proliferation of hepatocytes were studied .
2 . the culture of cells and the loading of fluid shear stress ;
3 . Experimental group : 1 ) Control group ( B0 group ) : no recording should be recorded ( B - OVF / cm2 ) ;
( 2 ) Group B12 / cm2 ( B12 group ) : Apply a tensile stress ( B - 12hr / cm2 ) to the cultured cells ;
3 ) Twenty - four ( 24 / cm2 ) groups were added to the cultured cells ( group B24 ) , and the cultured cells were subjected to a shear stress ( B & # x2212 ; 24 & # x2212 ; 24 & # xb7 ; cm2 ) ;
4 . Direct cell count and CCK - 8 were used to detect cell proliferation .
1 . The specific inhibitor PD98059 was used to treat the cell 2 in the intervention group , and the cell culture and the fluid shear stress were loaded .
3 . Experimental group : 1 ) Control group : the cells were placed in fluid stress loading system at the same time without exerting force on it nor administered inhibitor ;
2 ) simple pressurizing group : only the cells were loaded with the fluid shear stress of 24 & lt ; 2 & gt ; / cm & lt ; 2 & gt ; respectively ;
3 ) Intervention group : PD98059 treatment was performed in advance while the cell was loaded with a fluid shear stress of 24 & lt ; 2 & gt ; / cm & lt ; 2 & gt ; .
4 . Direct cell count and CCK - 8 were used to detect cell proliferation .
5 . Western blot analysis and fluorescence quantitative PCR detection ;
The results were as follows : ( 1 ) The number of cells in group B 24 increased rapidly after 24 hours . The number of cells in group B 24 was significantly higher than that in control group ( P0.05 ) . At the same time , the absorbance of B24 group was significantly higher than that in group B ( group B 24 ) : the same time , the absorbance of B24 group was significantly higher than that in B12 group ( P0.05 ) . ( group C ) : The number of cells in group B was significantly higher than that in group A ( P 0.05 ) . The number of cells in group B was significantly higher than that in group A ( P0.05 ) . The expression levels of Cyclin D1 and 尾 - Actin in group B were significantly higher than those in group A ( P0.05 ) .
The effect of shear stress on the proliferation and proliferation was observed in the rat model , which was significantly larger than that of the loading and cutting stress group and the control group .
( 2 ) The inhibition of Ras / MAPK signaling pathway can reduce the shear stress and promote the proliferation of hepatocytes .
However , it is not possible to completely inhibit the effect of shear stress on the proliferation of hepatocytes . It is indicated that the stress - promoting cell proliferation is related to the activation of Ras / MAPK signaling pathway .
Ras / MAPK signaling pathway is not the only way to promote the proliferation of hepatocytes .

【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R657.3

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