CYLD在瘢痕疙瘩中的表达及曲古抑菌素A和三羟基异黄酮对CYLD的影响

发布时间：2018-05-02 13:06

  本文选题：瘢痕疙瘩 + CYLD　； 参考：《重庆医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：第一部分CYLD在瘢痕疙瘩及正常皮肤组织中的表达及意义目的：探讨肿瘤抑制基因CYLD在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕、正常皮肤及正常瘢痕成纤维细胞中是否存在异常表达,以期能为瘢痕疙瘩的治疗找到一个新的作用位点。方法：收集临床手术切除的皮肤标本72例,分为正常皮肤组(A组)、正常瘢痕组(B组)、瘢痕疙瘩组(C组)、增生性瘢痕组(D组)。免疫组织化学技术(SP法)和Western-blot检测各组CYLD的表达情况并对结果进行差异比较；另收集瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及周围正常皮肤组织,采用组织块贴壁法进行原代成纤维细胞培养,Western-blot检测CYLD基因在三种成纤维细胞中的表达情况。结果：①免疫组化结果表明CYLD蛋白在A组(0.776±0.150)与B组(0.706±0.065)中的阳性表达明显高于C组(0.173±0.070)与D组(0.213±0.107)；C组、D组分别于A组比较(P值均为0.00,P0.05),C组、D组分别与B组比较(P值均为0.00,P0.05)差异均具有统计学意义；②Western-blot结果显示CYLD蛋白在正常皮肤(0.550±0.024)与正常瘢痕组织(0.442±0.075)中的表达明显高于瘢痕疙瘩(0.068±0.013)与增生性瘢痕(0.178±0.026)；③CYLD蛋白在正常成纤维细胞(0.564±0.037)中的表达同样明显高于瘢痕疙瘩(0.240±0.022)与增生性瘢痕成纤维细胞(0.256±0.038)。结论：CYLD在瘢痕疙瘩组织及细胞中的表达均低于正常皮肤与正常瘢痕,表明CYLD基因的低表达可能与瘢痕疙瘩的形成具有一定的关系。第二部分曲古抑菌素A和三羟基异黄酮对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及CYLD基因表达的影响目的：研究乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TrichostatinA, TSA)和三羟基异黄酮(three hydroxy isoflavone, Genistein)对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblasts, KFb)的增殖、凋亡及对肿瘤抑制基因CYLD表达的影响。方法：采用组织块法原代培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞,用不同浓度的Genistein和TSA作用于KFb,通过MTT实验计算药物的半数抑制浓度(IC50)及最佳干预时间。实验分为四组,TSA组(T组)：添加含IC50 TSA的培养液处理；Genistein组(G组)：添加含IC50 Genistein的培养液处理;TSA+Genistein组(T+G组)：添加含IC50的TSA与Genistein的培养液处理;空白对照组：只加入等量的培养基。锥虫蓝拒染法观察药物对KFb生长的影响；流式细胞仪检测各干预及对照组成纤维细胞的周期及凋亡；实时荧光定量PCR检测药物干预后各组细胞CYLD基因mRNA的表达情况；Western-blot检测药物干预后各组细胞CYLD蛋白的表达情况。结果：①根据MTT结果选择600nmol/L的TSA和100μmol/L的Genistein做为后续实验的最佳干预剂量；②流式细胞术结果表明,Genistein组、TSA组、TSA+Genistein组中G2/M期细胞所占百分比分别为(10.82±0.31)%、(11.11±0.58)%、(17.60±0.62)%,高于对照组的(7.11±0.58)%,(F=198.714,P=0.000)；G0/G1期细胞所占百分比分别为(59.25±1.23)%、(60.26±0.74)%、(48.69±1.55)%,低于对照组的(74.21±2.40)%, (F=-128.458,P=0.000)。Genistein组、TSA组、TSA+Genistein组细胞凋亡率分别为(31.40±4.07)%、(32.90±3.87)%、(61.09±0.55)%,与对照组(4.31±2.12)%比较,差异具有明显统计学意义(F=177.439,P=0.000)。③荧光定量PCR结果显示CYLDmRNA在TSA组(1.16±0.16)、Genistein组(1.00±0.09)、TSA+Genistein组(1.45±0.09)中的表达较对照组(0.47±0.10)明显升高(F=36.373,P=0.000)。④Western blot结果表明CYLD蛋白在TSA组(0.53±0.04)、Genistein组(0.52±0.03)、TSA+Genistein组(0.87±0.05)中的表达明显高于对照组(0.26±0.02),(F=132.629,P=0.000)。结论：曲古抑菌素A与三羟基异黄酮在单独或联合作用下均可促进瘢痕成纤维细胞的凋亡并抑制其增殖,作用机制可能与曲古抑菌素A和三羟基异黄酮对肿瘤抑制基因CYLD表达的上调有关。
[Abstract]:Part 1: the expression and significance of CYLD in keloid and normal skin tissue: To investigate whether the tumor suppressor gene CYLD has abnormal expression in keloid, hypertrophic scar, normal skin and normal scar fibroblasts in order to find a new action site for the treatment of keloid. 72 cases of surgical excised skin were divided into normal skin group (group A), normal scar group (group B), keloid group (group C), hypertrophic scar group (group D). Immunohistochemical technique (SP) and Western-blot were used to detect the expression of CYLD in each group and to compare the results, and to collect keloid, hypertrophic scar and normal skin. Tissue, tissue block adherence was used to culture the primary fibroblasts, and the expression of CYLD gene in three fibroblasts was detected by Western-blot. Results: (1) the immunohistochemical results showed that the positive expression of CYLD protein in group A (0.776 + 0.150) and B group (0.706 + 0.065) was significantly higher than that in group C (0.173 + 0.070) and D group (0.213 + 0.107); C Group D was compared in group A (P value was 0, P0.05), C group and D group were compared with B group (P value 0, P0.05), respectively. (2) Western-blot results showed that the expression of CYLD protein in normal skin (0.550 + 0.024) and normal scar tissue (0.442 + 0.075) was significantly higher than keloid (0.068 + 0.013) and proliferative The expression of CYLD protein in normal fibroblasts (0.564 + 0.037) was also significantly higher than that of keloid (0.240 + 0.022) and hypertrophic scar fibroblasts (0.256 + 0.038). Conclusion: the expression of CYLD in keloid tissues and cells is lower than normal skin and normal cicatricial scar, indicating that the low expression of CYLD gene can be expressed. It has a certain relationship with the formation of keloid. Second the effect of the second part of flexiostin and three hydroxyl isoflavones on the proliferation and CYLD gene expression of keloid fibroblasts: the study of acetyltransferase inhibitor, TrichostatinA, TSA, and three hydroxyisoHuang Tong (three hydroxy isoflavone, Genistein). The effects of Keloid fibroblasts (KFb) on the proliferation, apoptosis and the expression of tumor suppressor gene CYLD. Methods: the human keloid fibroblasts were cultured by tissue block method, the Genistein and TSA concentrations were used in KFb, and the median inhibitory concentration (IC50) of the drug was calculated through the MTT test. The best intervention time. The experiment was divided into four groups, group TSA (group T): adding culture solution containing IC50 TSA; Genistein group (group G): adding culture solution containing IC50 Genistein; TSA+Genistein group (T+G group): adding IC50 TSA and culture solution; blank control group: only the same amount of culture medium. Trypanosomiasis exclusion method Observe the effect of drug on the growth of KFb; flow cytometry to detect the cycle and apoptosis of the cells of each intervention and control; real-time fluorescence quantitative PCR to detect the expression of CYLD gene mRNA in each group after drug intervention; Western-blot detection of the expression of CYLD protein in each group after drug intervention. Results: (1) according to the results of MTT selection TSA of 600nmol/L and Genistein of 100 mu mol/L were the best intervention doses for subsequent experiments; the results of flow cytometry showed that the percentage of G2/M phase cells in group Genistein, TSA and TSA+Genistein was (10.82 + 0.31)%, (11.11 + 0.58)%, (17.60 + 0.62)%, higher than that of the control group (7.11 + 0.58)%, (F=198.714, P=0.000); G0/G1 period. The percentage of cells was (59.25 + 1.23)%, (60.26 + 0.74)%, (48.69 + 1.55)%, lower than that of the control group (74.21 + 2.40)%, (F=-128.458, P=0.000).Genistein, TSA, group TSA, and group TSA+Genistein, respectively (31.40 + 4.07)%, (32.90 + 3.87)%, (61.09 +%)%, compared with the control group. F=177.439 (P=0.000). (3) the results of fluorescence quantitative PCR showed that CYLDmRNA was in group TSA (1.16 + 0.16), Genistein group (1 + 0.09), and TSA+Genistein group (1.45 + 0.09) significantly increased (0.47 + 0.10) (F=36.373, P=0.000). (4) Western blot fruit showed that CYLD protein was (0.53 + 0.04) and 0.52 + 0.03 (0.53 + 0.03). The expression in group n (0.87 + 0.05) was significantly higher than that in the control group (0.26 + 0.02) (0.26 + 0.02), (F=132.629, P=0.000). Conclusion: the apoptosis of cicatricial fibroblasts and the inhibition of the proliferation of cicatricial fibroblasts can be promoted by the single or combined effect of trihydroxyisoflavone A and three hydroxyl isoflavones. The mechanism may be related to the tumor suppressor gene CYLD of the triad and three hydroxyl isoflavones. The up-regulated expression of the expression is related.

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R622

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本文编号：1834027