MGF对人退变椎间盘软骨终板干细胞的影响及机制研究

发布时间：2018-05-02 19:40

本文选题：椎间盘退行性疾病 + 软骨终板干细胞　；参考：《第三军医大学》2015年硕士论文

【摘要】：研究背景:腰椎间盘退行性病变(degenerative disc disease,DDD)是人类的一类较严重的慢性病,也是导致腰部疼痛(low back pain,LBP)发生的一个关键诱因,在很大程度上致使了人类生活幸福感得下降。如今临床上用来对付DDD的主流方法是手术疗法和保守疗法这两大措施。其中手术疗法一般是椎间盘融合术以及髓核切除术这两种主流通行的手术途径。虽然手术治疗能够在一定程度上通过去除病变组织从而缓解患者的痛苦,但是这并没有从根本上去解决椎间盘退变所导致的功能缺失。近些年,快速前进的生物学基础领域,带给了脊柱外科一些新的防治手段,结合生物组织工程应用、干细胞治疗,不少学者提出这二者的结合可能是防治DDD的新方法。此前的报道显示髓核(Nucleus pulposus,NP)的营养是由椎间盘中的软骨终板(cartilage endplate,CEP)组织是供应的,且CEP还是其主要的通道,因此不少研究者认为如果CEP发生退化,也将成为诱使椎间盘退行性病变发生的关键诱因之一。2011年,CEP中存在着干性细胞的这一现象首先被我们的研究小组发现,这类干性细胞被称为软骨终板干细胞(cartilage endplate derived stem cells,CESCs)。此外研究小组的实验还发现CESCs具有较强的克隆形成能力,拥有多向分化的潜能,所以CESCs具有成为防治DDD和生物组织工程应用中新的细胞资源的可能性。早前的研究提示CEP细胞能够定向迁移到NP组织并可以成功转变成为NPCs。假如我们能够激活CESCs,促使其增殖,调节其分化,且维持住CEP的健康形态,继而诱导CESCs定向朝NP组织迁移,将会给DDD的治疗带来新的途径。力生长因子(mechano growth factor,MGF)在1996年被Yang等人发现。研究显示MGF属于类胰岛素生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)家族,是其数个剪接变异体的其中一个,在动物体内被称为IGF-1Eb,在人体内则被命名为IGF-1Ec。多项报告提示MGF广泛出现在许多组织,除了能刺激成肌细胞、成骨细胞等力效应细胞出现增殖和迁移的行为以外,此外还能延迟成骨分化行为的发生,最重要的是还拥有在组织遭受损害时减少细胞死亡数量的作用。其中MGF刺激细胞增殖和迁移的作用主要与Erk的活化有关,即其磷酸化水平的增加可导致上述行为的发生。最近的报告显示mgf能够诱使bmscs迁移效应的发生。考虑到cescs是一类间充质来源细胞,在细胞学特性方面和bmscs拥有类似的特点,据此我们猜测cescs在mgf的刺激下也许能产生同样的效应。但国内外针对mgf对cescs的效应和控制效应发生的机制的报道非常少。本课题通过相应的体外细胞实验,观察cescs在mgf的刺激下,其增殖、迁移和分化行为发生的变化,并对mgf部分效应的调节途径也做一定的摸索。研究目的:此课题是依靠临床手术收集患者的退变腰椎间盘cep组织,使用机械清除法去除cep周围无用部分,剪碎cep,用ii胶原酶消化cep获得cep细胞。提取得到的cep细胞通过琼脂糖筛选系统后再体外扩增培养,展开一系列体外试验,包括鉴定cescs的干性,观察cescs在mgf的刺激下其增殖、迁移和分化的变化。证实提取的软骨终板细胞具有干细胞特性,以及mgf对cescs细胞增殖、迁移、分化的影响以及其作用机制。实验方法:从临床上选取多例因腰椎间盘退变需行椎间盘融合术的患者,在患者行融合术后收集取出的椎间盘组织,超净工作台下对标本进行处理,磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer,pbs)处理完,标本剪成大小不超过1mm3得碎块,用1%ii型胶原酶在37℃下过夜消化,获得cep细胞后,加入适量完全培养液后放置到培养箱进行培养。采用琼脂糖筛选系统筛选培养后,使用流式细胞仪测定干细胞标志物,进行三系诱导分化染色鉴定。选取筛选后生长状态良好的cescs,加入不同浓度的mgf溶液,进行增殖实验和transwell实验。应用westernblot检测erk磷酸化的表达。选取筛选后的cescs细胞进行成骨、成软骨诱导分化实验,加入mgf,诱导周期结束后,使用qpcr测定成骨、成软骨相关基因的表达。实验重复三次以上,拍摄的照片被拿来做定性分析,数据用spss20.0软件做统计学分析,定量数据采取平均数±标准差的方式实施显示,两个组之间可以使用t检验进行对比,多组可以采取单因素方差分析进行显示。本次试验设定p0.05是表示有统计学上的差异的。实验结果:1.获取得cep细胞通过琼脂糖系统筛选扩增后,利用流式细胞术检测干细胞标志物以及三系诱导分化的实验证实筛选的cep细胞拥有干细胞生物学特性,为cescs。2.cescs增殖实验中,通过cck-8检测,显示实验组(mgf组)od值高于对照组,其中4.5ng/ml组最显著(P0.05)。并且用Erk拮抗剂PD98059预先作用CESCs后,MGF的促增殖作用显著下降(P0.05)。Transwell实验同样提示实验组(MGF组)迁移细胞数目多于对照组,其中4.5ng/ml组细胞数目最多(P0.05)。醋酸溶液洗脱结晶紫后,用酶标仪在570nm波长下测量吸光度,4.5ng/ml组的OD值也是最大的(P0.05)。用IGF-1R拮抗剂PQ401预处理细胞后,MGF诱使细胞发生迁移行为的作用降低(P0.05)。Western blot证实4.5ng/ml时Erk磷酸化水平显著增高(P0.05),加入IGF-1R抑制剂PQ401后,Erk磷酸化显著下降(P0.05)。3.CESCs分化实验中,特殊染色实验显示MGF能抑制CESCs成骨分化,促进成软骨分化;通过qPCR测量,成骨诱导分化实验中,实验组(MGF组)CESCs成骨相关基因表达降低,说明MGF在该浓度水平下抑制CESCs成骨诱导分化。成软骨分化实验中,特殊染色实验显示MGF促进CESCs成软骨分化;实验组(MGF组)CESCs成软骨相关基因表达相比对照组提升了很多,提示MGF在该浓度水平下促进了CESCs的成软骨分化。结论:1.证实从CEP获取的细胞经琼脂糖筛选系统的筛选后是CESCs,拥有干细胞的生物学性质;2.证实MGF能诱导CESCs发生增殖和迁移的行为,该作用与Erk通路的活性有联系,其磷酸化水平增高促进上述行为的发生。其中IGF-1R为MGF促迁移作用中的关键元件。3.MGF拥有提升CESCs向成软骨分化及降低CESCs向成骨分化的作用。
[Abstract]:Background : degenerative disc disease ( DDD ) is one of the most serious chronic diseases in humans , and it is a key factor leading to the occurrence of low back pain . This study suggests that the proliferation , migration and differentiation of CESCs can lead to the proliferation , migration and differentiation of the cells . The results suggest that MGF is a kind of mesenchymal origin cell which can induce the proliferation , migration and differentiation of the cells . The results were as follows : 1 . After screening and amplification of cep cells , the cell markers were measured by flow cytometry . The results showed that the number of cells in the experimental group was higher than that in the control group ( P0.05 ) . IGF - 1R is the key element in promoting migration of MGF . 3 . MGF has the function of promoting differentiation of CESCs to chondrogenic differentiation and decreasing the differentiation of CESCs into osteogenic differentiation .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R681.53

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