SDF-1复合PDPBB的构建及对间充质干细胞趋化影响的研究

发布时间：2018-05-05 05:08

本文选题：间充质干细胞 + SDF-1　；参考：《昆明医科大学》2015年博士论文

【摘要】：[研究背景及目的]临床上因多种原因造成的人体骨组织缺损,是目前临床医学急需解决的难题之一。移植材料与骨缺损范围之间的供求矛盾是需要面对的难点。因此,构建组织相容性好,无排异反应,血管化良好的组织工程骨,是组织工程骨研究的关键。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)具有多向分化潜能,在不同诱导条件下,能向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等中胚层及外胚层组织分化,因此,干细胞在再生医学领域,特别在于修复和替代病变细胞、组织及器官等方面起到了重要的作用。基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)是目前已知的对干细胞有明显趋化作用的因子。SDF-1复合部分脱蛋白生物骨构建的组织工程骨是否可促进干细胞的趋化,进而促进局部骨缺损愈合,目前尚无研究以证明。因此,我们将SDF-1因子复合于部分脱蛋白骨上,构建SDF-1复合部分脱蛋白生物骨,并通过生物活体成像技术,以了解体外及活体内SDF-1复合部分脱蛋白生物骨对干细胞的趋化作用。以为解决骨移植材料紧缺而提供一条有效的途径。[方法](1)通过构建表达荧光素酶的慢病毒载体转染小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2细胞,Western blotting检测慢病毒感染的C3H10T1/2细胞中荧光素酶的表达,将重组pLVX-IRES-Puro-Luciferase病毒感染的C3H10T1/2细胞用免疫荧光检测FLAG的表达以检测转染效率。并将稳定表达荧光素酶的间充质干细胞C3H10T1/2-luci移植于C3H小鼠,经注射底物后XENOGEN活体生物发光系统检测。(2)制造小鼠骨缺损模型,并在不同时相检测局部SDF-1的表达,以了解骨缺损后局部SDF-1分泌动态变化的过程。(3)通过体外迁移小室模型,研究不同浓度的SDF-1对C3H10T1/2细胞迁移的影响。(4)将SDF-1复合于部分脱蛋白生物骨(partially deproteinised biological bone, PDPBB)上构建组织工程生物骨。并检测SDF-1复合PDPBB对C3H10T1/2细胞趋化作用的影响,同时将SDF-1复合PDPBB植入小鼠体内,进行活体成像,术后X线摄片及HE切片检查,了解其在活体内对间充质干细胞趋化作用的影响及其在体内的耐受性。[结果](1)慢病毒表达载体pLenti-TRIM69的酶切鉴定和测序,测序结果与已知的荧光素酶序列完全一致,表明重组质粒构建成功。将得到的耐药细胞株细胞用Western blotting检测FLAG的表达,结果显示此细胞表达的蛋白大小与预期相符(约60KD),表明感染病毒的C3H10T1/2细胞表达荧光素酶蛋白。将重组pLVX-IRES-Puro-Luciferase病毒感染的C3H10T1/2细胞用免疫荧光检测FLAG的表达,结果显示,与未感染病毒的正常对照组相比,感染病毒的细胞组约100%细胞红色荧光呈阳性。表明已经构建好稳定表达荧光素酶的C3H10T1/2细胞。与C3H10T1/2对照组相比,荧光素酶基因转染的C3H10T1/2-luci组荧光素酶活性明显升高,并呈现出良好的倍数关系。稳定表达荧光素酶的间充质干细胞移植于C3H小鼠,XENOGEN活体成像系统可检测到荧光信号,信号强度与植入细胞数量相关,说明荧光素酶表达的间充质干细胞构建成功。(2)动物生存情况,除一只在术中死亡外,其余动物均术后存活,进食活动正常,未出现伤口感染情况。免疫组织化学法的结果。骨缺损模型建立后SDF-1表达明显增高,在不同时间点均有较高表达,向较健康无骨缺损侧表达增高。二者之间差异性有统计学意义。(3)与阴性对照组相比,50ng/ml的SDF-1即可有效地引发C3H10T1/2细胞的迁移；但200ng/ml与400ng/ml不同浓度的SDF-1所引发的迁移效应并无明显差异。(4)与部分脱蛋白骨相比,经SDF-1(200ng/ml)处理后的PDPBB对C3H10T1/2-luci细胞具有一定的趋化作用,并呈现较好的时效关系(p0.01)。C3H10T1/2-luci细胞于术后当天分别注射于SDF-1复合PDPBB组,部分脱蛋白骨组,单纯骨缺损组C3H小鼠,注射部位为右下腹部皮下,经注射底物后XENOGEN活体成像系统检测。注射后当天,三组注射局部可见明显的荧光信号。术后第2天,SDF-1复合部分脱蛋白生物组小鼠局部可见荧光信号向右侧股骨手术部位迁移趋势。三组小鼠局部注射后的第4天荧光信号逐渐减弱,移植后2周局部均不能检测到荧光信号。于术后第4,6,8周处死小鼠,去除肌肉及周围组织,取右侧股骨。行X线摄片,了解局部成骨情况。并行H-E切片观察局部成骨情况。可见SDF-1复合部分脱蛋白生物骨植入后局部骨缺损部分可见炎症细胞浸润,并可见SDF-1复合部分脱蛋白生物骨逐渐被周围组织浸润及吸收。术后4周,X线摄片可见SDF-1复合PDPBB组,部分脱蛋白骨组股骨缺损局部可见生物骨植入,3组股骨缺损周围均可见不连续的纤维骨痂生成。术后6周,X线摄片可见SDF-1复合PDPBB组股骨缺损局部可见连续的骨性骨痂生成。部分脱蛋白骨组,单纯骨缺损组骨性骨痂不连续。术后8周,X线摄片可见SDF-1复合PDPBB组股骨缺损局部可见连续的骨性骨痂生成,骨皮质连续,局部愈合良好。部分脱蛋白骨组骨皮质模糊,单纯骨缺损组欠连续。SDF-1复合PDPBB组X线下观察愈合较部分脱蛋白骨组,单纯骨缺损组快。提示SDF-1复合PDPBB植入后可促进局部骨缺损愈合,组织相容性好,无明显不良反应。[结论](1)获得荧光素酶稳定表达的间充质干细胞系C3H10T1/2-luci。转染效果确切,荧光素酶基因表达稳定。为下一步研究提供了稳定的示踪细胞。(2)成功构建了小鼠股骨缺损模型,安全有效,可重复性好。在骨缺损修复过程的各时相点,SDF-1均有较高的表达量。(3)SDF-1在体外对间充质干细胞系C3H10T1/2细胞有明显的浓度依赖性趋化作用。在一定浓度内,SDF-1对C3H10T1/2细胞的趋化作用呈正相关,而过高浓度的SDF-1并不能无限度提高对C3H10T1/2细胞的趋化能力。(4)本课题中制备的部分脱蛋白骨来源丰富、制作要求低、难度小、费用低,SDF-1复合PDPBB对C3H10T1/2-luci细胞具有较强的趋化作用。活体生物成像检测发现SDF-1复合PDPBB对间充质干细胞有一定的趋化作用。该项研究技术成熟稳定,效果良好。
[Abstract]:Objective To investigate the effects of SDF - 1 on bone graft in vitro and in vivo . The effect of SDF - 1 compound PDPBB on the localization of C3H10T1 / 2 cells was detected by Western blotting .
The results showed that SDF - 1 combined with PDPBB had no obvious difference in bone callus formation . After 6 weeks of operation , it was found that SDF - 1 combined with PDPBB had no obvious effect on local bone defects .

【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R687;R318.08

【参考文献】