脊髓康干预Nogo-NgR信号通路调节脊髓损伤后神经再生的实验研究

发布时间：2018-05-14 22:26

本文选题：脊髓康 + 大鼠　；参考：《南京中医药大学》2015年博士论文

【摘要】：背景脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)后神经再生困难是世界性难题,目前认为主要与中枢神经系统微环境内抑制性因素相关。Nogo蛋白、髓磷脂相关糖蛋白(myelin-associated glycoprotein, MAG)和少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein, OMgp)目前被认为是影响脊髓损伤修复的髓磷脂抑制因子,三者均可与Nogo受体(nogo receptor, NgR)结合,能抑制成熟中枢神经元轴突再生及诱导生长锥溃变,从而达到抑制脊髓损伤修复。其中,Nogo蛋白抑制作用最为明显,针对Nogo-NgR通路在脊髓损伤修复中作用机制探讨已成为目前国内外研究热点。中药“脊髓康”作为我们临床经验方,前期研究发现具有镇痛、抗炎、促进神经营养因子表达等作用。然而,“脊髓康”促进脊髓损伤修复的作用机制尚不清楚。为此,本研究通过制备大鼠脊髓损伤模型,观察脊髓损伤后脊髓组织中Nogo-NgR通路的动态表达变化,探讨“脊髓康”能否通过干预Nogo-NgR信号通路改善中枢神经系统微环境以促进脊髓损伤后神经再生。目的按照改良Allen's法制备脊髓损伤模型,观察大鼠脊髓损伤后脊髓组织中Nogo、NgR的免疫组化、Western blottingting及荧光定量PCR的动态表达情况,探讨Nogo-NgR信号通路在神经再生过程中的作用和意义；观察中药“脊髓康”对大鼠脊髓损伤后脊髓组织病理组织结构、细胞凋亡、生长相关蛋白(growth associated protein-43, GAP-43)及Nogo-A、NgR的影响,探讨其促进脊髓损伤后神经再生的作用机制。方法1、将108只SD大鼠随机分成正常组(N组)、假手术组(A组)和模型组(B组),每组36只。N组不做任何处理,A组咬除T10棘突及椎板,避免损伤脊髓,B组按照改良Allen's法造模,分别于干预后24h、3d、7d、14 d处死大鼠,每组9只,以免疫组化及Western blottingting检测各组大鼠脊髓组织中Nogo-A、NgR蛋白的表达变化,以荧光定量PCR检测：Nogo-A、NgR mRNA的表达变化。2、将180只SD大鼠随机分为假手术组(A)、模型组(B)、强的松组(C)、脊髓康高剂量组(D)、脊髓康中剂量组(E)、脊髓康低剂量组(F),每组30只。B、C、D、E、F组均按照改良Allen's法制备脊髓损伤模型,麻醉苏醒后C组大鼠灌胃给药强的松0.06g/(kg.d), D组给药“脊髓康”50g/(kg.d),E组给药“脊髓康"25g/(kg.d),F组给药“脊髓康”12.5g/(kg.d), A组和B组均给予同等剂量的生理盐水灌胃。观察各组大鼠在3d、7d、14d时间点HE染色、透视电镜、细胞凋亡、GAP-43蛋白、Nogo-A、NgR蛋白及mRNA的表达变化。结果1、Nogo-NgR信号通路在大鼠脊髓损伤组织中的动态表达及意义免疫组化、Western blottingting及荧光定量PCR显示,与假手术组比较,SCI后24h模型组Nogo-A、NgR蛋白和mRNA表达较低,3d后下降至最低,7d后迅速上升达到高峰,至14d逐渐下降,但仍高于假手术组。2、“脊髓康”对大鼠脊髓损伤后组织形态结构的影响HE染色显示,SCI后3d模型组出现明显脊髓组织结构破坏,神经元固缩、坏死,7d时脊髓组织结构进一步破坏,并可见胶质细胞浸润,14d时脊髓组织胶质细胞数量较7d增多,并见较多炎症细胞浸润。而强的松组及脊髓康高、中、低组在各时间点脊髓组织结构损伤均较模型组轻微,尤以强的松组和脊髓康中剂量组明显。透视电镜显示,SCI后3d模型组出现神经元细胞膜破裂,线粒体肿胀明显,染色质边集及核碎裂,髓鞘结构紊乱,7d时损伤呈进行性加重。而强的松组及脊髓康高、中、低组在各时间点脊髓组织结构损伤均较模型组轻微,尤以强的松组和脊髓康中剂量组明显。3、“脊髓康”对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡及GAP-43蛋白的影响细胞凋亡免疫组化显示,SCI后各时间点,模型组凋亡细胞数均为最多(P0.01)。术后3d时强的松组凋亡细胞数最少(P0.05),术后7d时强的松组与高剂量组疗效优于其余各组,术后14d时强的松组与中剂量组疗效较优。GAP-43蛋白免疫组化显示,脊髓损伤各组在各时间点GAP-43蛋白表达均出现不同程度增高,且均在7d时达到最高(P0.05)。在3d、7d、14d各时间点,强的松组和中剂量组GAP-43蛋白表达均明显高于模型组(P0.01)。在7d、14d时,脊髓康高、低剂量组GAP-43蛋白表达亦明显高于模型组(P0.05)4、中药“脊髓康”调节Nogo-NgR信号通路的机制研究免疫组化、Western blottingting及荧光定量PCR显示,大鼠SCI后3d时模型组、强的松组及脊髓康高、中、低各组Nogo-A、NgR蛋白及mRNA表达量较低,7d时表达量明显增高,14d时出现不同程度下降。与模型组比较,SCI后3d、7d、14d时强的松组和脊髓康中剂量组Nogo-A、NgR蛋白及mRNA表达量差异均有统计学意义(P0.05)。结论1.大鼠SCI后,Nogo-A、NgR蛋白在早期一过性下降后均在7d时上升达到最高峰,并可持续保持高水平表达,可能是造成脊髓损伤后中枢神经系统神经再生困难的重要原因之一。2.“脊髓康”可减少SCI后细胞凋亡,维持髓鞘板层结构的稳定,上调GAP-43蛋白的表达,抑制脊髓损伤区Nogo和NgR蛋白的表达。其中,脊髓康中剂量组疗效优于低、高剂量组,与强的松相似。这可能是“脊髓康”改善轴突再生微环境,从而阻断髓鞘源神经再生抑制因子作用,促进脊髓损伤修复的作用机制之一。
[Abstract]:In this study , the effects of Nogo receptor ( Nogo receptor ) on spinal cord injury were investigated .
Methods One hundred and eighty SD rats were randomly divided into normal group ( group N ) , model group ( group A ) and model group ( group B ) . The changes of apoptosis , GAP - 43 protein , Nogo - A , nR protein and mRNA were observed . Results 1 . The expression of Nogo - A , NR protein and mRNA in spinal cord injury of rats were lower than those in sham operation group . The expression of GAP - 43 protein in spinal cord injury group was significantly higher than that in model group ( P0.05 ) . At 7 d , 7 d , 14 d , the expression of GAP - 43 protein in the group of prednisone group and middle dose group was significantly higher than that in model group ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.2

【参考文献】