纳米荧光材料经硬膜外腔给药实现脊髓快速荧光成像的实验研究

发布时间：2018-05-17 09:02

本文选题：荧光成像 + 图像引导手术　；参考：《吉林大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:医源性脊髓损伤(SCI)是脊柱手术中最为灾难性并发症之一,常可导致患者严重且永久性残疾。然而,现有的诊断技术和监测手段如MRI、术中电生理监测(IOM)和神经示踪技术等仍无法满足提升术中直视下脊髓的可视度及有效地可视化监测脊髓完整性的临床需求。荧光指导手术(FGS)是一项新兴的能够提高术中可视性及精准度的成像技术,但由于血脑屏障的存在使得荧光标记物难于进入脊髓,因此目前尚无关于术中脊髓荧光成像的系统研究报道。本研究合成了一种纳米荧光材料(BMB-m),首次尝试通过硬膜外腔给药来实现兔全脊髓快速荧光成像,并初步探讨其在实时可视化监测术中脊髓完整性及损伤的价值。目的:探讨纳米荧光材料经硬膜外腔途径给药来实现脊髓快速荧光成像的可行性;同时,阐明脊髓快速荧光成像的机理;此外,初步评价脊髓快速荧光成像在可视化监测术中脊髓损伤的价值及安全性。方法:(1)纳米荧光材料(BMB-m)的合成及表征:选择了一种具有神经组织特异结合能力的荧光分子1,4-双(p-氨基苯乙烯基)-2-甲氧基苯(BMB),并将其担载于高分子胶束中形成荧光纳米胶束(BMB-micelle,BMB-m)。通过透射电子显微镜(TEM)和分光光度计等测定BMB-m的理化及光学特性。(2)在体实验:实验动物为日本大白兔(雌雄随机,体重约为2.5kg),将纳米荧光材料(BMB-m)经硬膜外腔途径给药,评价不同剂量组(10μg/只、30μg/只、50μg/只、100μg/只,同一时间点:30分钟,剂量指bmb-m中bmb的净含量)和不同时间点(15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、14小时和24小时,同一剂量50μg/只)的在体荧光成像效果,(n=3)。对照组包括正常对照组、假手术对照组、单纯生理盐水组、高分子胶束+生理盐水组、静脉给药组,(n=3)。利用动物荧光成像系统(fis)在同一标准下(20ms曝光时间)拍摄并记录显露后的脊髓、坐骨神经及周围组织的白光和荧光图像。(3)脊髓快速荧光成像机理探讨相关的方法:1)观察腰部神经根荧光成像情况;2)利用激光共聚焦扫描显微镜(clsm)测定脊髓不同部位横断面的荧光强度和厚度;3)通过反相高效液相色谱法-电喷雾质谱法(rp-hplc-esi-ms)检测脑脊液中是否存在bmb;4)实时原位观察硬膜外腔给药后t10脊髓荧光的动态变化。(4)脊髓快速荧光成像可视化监测术中脊髓损伤的初步评价:bmb-m溶液(含50μgbmb)经硬膜外腔给药后30分钟,在t10水平构建两种经典的脊髓损伤模型(rivlin法夹伤模型和allen法重物坠击伤模型),观察并记录损伤前后t10脊髓的白光和荧光图像;并通过激光共聚焦扫描显微镜(clsm)进一步检测损伤及邻近非损伤部位的脊髓横断面荧光变化情况。(5)纳米荧光材料经硬膜外腔途径给药的安全性评价:通过细胞毒性实验(pc-12神经细胞和l929成纤维细胞)和组织病理学检测(脊髓、主要脏器及组织的he染色)评价纳米荧光材料的毒性作用。结果:(1)合成的纳米荧光材料(bmb-m)在常温下呈黄色絮状固体,其改善了bmb的溶解性且可配制成不同溶度(0.05mg/ml~0.5mg/ml)的bmb生理盐水溶液。透射电子显微镜(tem)下观察到bmb-m具有球形核-壳结构,大小较均匀(平均粒径为84nm);bmb-m的激发波长和发射波长峰值分别为385nm和525nm。(2)不同剂量组在体实验结果显示:剂量为10μg/只时就可实现全脊柱荧光成像;50μg/只剂量组的脊髓/脂肪荧光强度比值(sc/a比值)显著高于10μg/只和30μg/只剂量组的(p0.05),而与100μg/只剂量组的sc/a比值之间无显著性差异(p0.05);此外,进一步比较不同脊髓部位(腰、胸、颈)的sc/a的差异:在10μg/只剂量组,腰髓的sc/a比值显著高于胸髓和颈髓的(p0.05);在30μg/只至100μg/只剂量组,腰髓和胸髓的sc/a比值显著高于颈髓的(p0.05)。不同时间点在体实验结果显示:在硬膜外腔给药后15分钟就可实现全脊柱荧光成像,最强荧光出现在给药后30分钟;随后,荧光信号逐渐减弱,直至在给药后24小时消失;腰、胸、颈髓的有效荧光强度(sc/a比值2)分别可持续14小时、8小时和2小时。经硬膜外腔和静脉两种途径给药的成像效果比较:相对于静脉给药(5mg/只,为硬膜外腔给药剂量的100倍),硬膜外腔给药(50μg/只)的sc/a比值是静脉的19.1倍。此外,静脉给药组的坐骨神经、肌肉及肝肾肺等重要脏器均可检测到荧光,而硬膜外腔给药组均无可检测得到的荧光。(3)通过机理研究发现脊髓快速荧光成像与脑脊液快速流动有关,证据如下:1)腰部神经根荧光信号止于背根神经节,这是由于脑脊液仅止于背根神经节;2)脊髓横断面clsm检测结果显示bmb主要与脊髓白质的四周结合,荧光强度和厚度从腰髓至颈髓呈显著性递减改变;3)通过反相高效液相色谱法-电喷雾质谱法(rp-hplc-esi-ms)在脑脊液中检测到BMB;4)实时动态观测到BMB随脑脊液由尾侧向头侧呈波浪样快速流动。(4)在两种脊髓损伤模型,损伤前T10脊髓的荧光均匀分布,损伤后脊髓损伤部位的荧光减弱明显甚至消失;进一步对损伤部位CLSM检测结果显示脊髓外周白质的解剖结构完整性破坏。(5)BMB-m和BMB对PC-12细胞和L929细胞的增殖无抑制作用,表明其具有低的细胞毒性。组织病理学检测结果显示:即使给药剂量达100μg/只,仍未在脊髓、主要脏器和组织中发现病理损伤改变。结论:本研究结果表明纳米荧光材料(BMB-m)通过硬膜外腔途径给药可实现兔脊髓的快速荧光成像;进一步机理研究揭示了BMB通过脑脊液输运快速分布到整个脊髓表面,并与脊髓外周白质结合,从而达到全脊髓的快速荧光成像;同时,初步发现脊髓快速荧光成像具有实时可视性监测术中脊髓完整性及损伤的潜力。此外,细胞毒性实验和组织病理学检测结果显示纳米荧光材料具有良好的生物相容性。
[Abstract]:BACKGROUND : Medical spinal cord injury ( SCI ) is one of the most disastrous complications in spinal surgery , which often leads to severe and permanent impairment of spinal cord . ( 2 ) In vivo experiment : experimental animals were Japanese rabbits ( male and female at random , body weight was about 2.5kg ) , and the fluorescent images of the spinal cord , sciatic nerve and surrounding tissues were assessed by using fluorescence imaging system ( fis ) at the same time ( 20 ms exposure time ) . ( 3 ) The fluorescence intensity and thickness of the cross section of spinal cord were measured by using fluorescence imaging system ( clsm ) . ( 4 ) Initial evaluation of spinal cord injury during spinal cord rapid fluorescence imaging : The toxicity of nano - fluorescent materials was evaluated by means of laser confocal scanning microscope ( clsm ) . The results showed that the ratio of sc / a of spinal cord to dorsal root ganglia was significantly higher than that in 100 渭g / dose group ( p < 0.05 ) . The results showed that BMB - m and BMB did not inhibit the proliferation of PC - 12 and L929 cells .
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R651.2

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