Smad7在Sox9协同BMP2软骨化中的作用研究

发布时间：2018-05-17 11:02

  本文选题：软骨分化 + Sox9　； 参考：《重庆医科大学》2015年硕士论文

【摘要】：骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2)隶属于BMPs家族,可诱导间充质干细胞(Mesenchymal stem cells)成软骨分化。因此被认为是构建基因强化的组织工程软骨的重要因子。联合运用Sox9可在增强BMP2诱导软骨化的同时抑制BMP2所介导的成骨分化,从而优化了成软骨效应,但其作用靶点仍不明确。而BMP2诱导下上调的Smad7作为成软骨负性因子被发现在软骨内成骨中起到重要作用,可能是Sox9作用的潜在靶点。本研究主要探讨Sox9与Smad7在BMP2诱导的软骨分化与软骨终末成熟骨化的关系,为组织工程软骨的构建与稳定提供新思路新靶点。方法：(1)用HEK293细胞扩增已经构建完成的腺病毒Ad-BMP2、 Ad-Smad7和Ad-Sox9后转染入小鼠骨髓MSCs C3H10T1/2,到达目标时间后Western-blot检测目的基因蛋白表达情况；(2)平面培养情况下按照测定滴度将AdBMP2, AdBMP2+AdSox9转染C3H10T1/2, AdGFP转染组作对照,以微球培养的方式模拟三维状态一直到14天,提取RNA逆转录后,QPCR检测各处理组不同时间点Smad7、OPN与MMP13；提取各种总的蛋白测定浓度后采用Western-blot技术检测各情况之下Smad7的蛋白水平；(3)平面培养的C3H10T1/2细胞用AdBMP2和／或AdSox9感染,以AdGFP感染组作对照,免疫细胞化学检测各处理组细胞基质Smad7表达情况；(4)通过裸鼠皮下注射高浓度的感染目的病毒的C3H10T1/2的方式构建成软骨成骨在体模型。将获得的骨块进行形态与组织观察,以了解Smad7在不同的水平下对BMP2介导的软骨化与软骨内成骨的作用。(5)感染离体的胎鼠肢芽,感染目标病毒,了解Smad7在不同水平下对软骨分化形成与软骨成熟骨化中的作用(6)通过对不同水平Smad7的细胞进行流式细胞检测,证实不同水平Smad7对BMP2诱导凋亡的影响。结果：(1)各重组腺病毒均可以有效转染C3H10T1/2细胞,并稳定表达相关蛋白。(2)在体外的微球培养中,BMP2可上调Smad7表达水平,而外源性高表达Sox9能抑制BMP2诱导的Smad7水平上调,Smad7相关因子OPN与MMP13基因表达水平也可被Sox9抑制。(3)在免疫组化实验中发现高表达的Sox9可抑制由BMP2所上调的Smad7表达,使其维持低表达状态。(4)裸鼠皮下种植成骨实验结果证实高表达Sox9组在抑制Smad7表达情况下促进BMP2诱导的软骨形成,抑制BMP2介导的软骨内化骨,而高表达Smad7组软骨与成骨均形成受抑。(5)胎鼠前肢器官培养发现Sox9抑制BMP2诱导的Smad7可促进肢芽软骨细胞的增殖分化而抑制肢芽软骨细胞肥大,而高表达Smad7抑制增殖区域加大肥大区域。(6)高表达Sox9组可降低BMP2诱导的凋亡,而高表达Smad7会提高BMP2诱导的凋亡。结论：Sox9可抑制BMP2诱导下的Smad7及其相关因子,从而解放软骨化阻碍软骨内成骨进程。通过调节Smad7表达水平可能达到增强软骨化抑制软骨终末成熟凋亡骨化的作用。为Sox9与BMP2的联合运用提供理论支持,为生物工程软骨的构建与稳定提供了新靶点。
[Abstract]:Bone morphogenetic protein - 2 ( BMP - 2 ) belongs to BMPs family and can induce mesenchymal stem cells to differentiate into cartilage .
( 2 ) AdBMP2 , AdBMP2 + AdSox9 were transfected into C3H10T1 / 2 and AdGFP transfection group under the condition of planar culture . The three - dimensional state was simulated in three - dimensional state until 14 days in the manner of microball culture . After RNA reverse transcription was extracted , the different time points of the various treatment groups were detected by QPCR , and the expression of Smad3 , osteal and MMP 13 were detected by QPCR .
Western - blot was used to detect the protein level of Smad3 in each case after extraction of various total protein concentrations .
( 3 ) AdBMP2 and / or AdSox9 were infected with AdBMP2 and / or AdSox9 in the C3H10T1 / 2 cells cultured in plane , and the expression of Smad3 expression was detected by immunohistochemistry in each treatment group .
( 4 ) In vitro microball culture , BMP2 could increase the expression level of BMP2 and inhibit BMP2 - induced apoptosis .
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R68

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本文编号：1901115