基于人尿源干细胞的骨组织工程研究

发布时间：2018-05-20 00:19

  本文选题：尿源干细胞 + 脂肪干细胞　； 参考：《上海交通大学》2015年博士论文

【摘要】：目的:本实验从成人清洁中段尿中分离尿源干细胞(human urine-derived stem cells,USCs),并探究USCs的生物学特征,通过增殖速度、表面标志物和多向分化潜能比较USCs与脂肪来源的干细胞(adipose-derived stem cells,ASCs)的生物学特征;在此基础上,探究骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein 2)转染对USCs成骨分化能力的影响;然后,研究USCs在磷酸三钙(β-TCP)上的生物学行为,最后,将USCs接种至β-TCP上并移植到大鼠股骨大段骨缺损中,探究USCs/β-TCP复合物对大段骨缺损的修复作用。方法:第一部分:收集健康成人清洁中段尿200 ml,离心洗涤后加入配制的专用培养基来培养USCs。通过CCK-8和流式细胞仪检测USCs增殖能力和表面标志物。加入诱导分化培养基,探究USCs成骨、成软骨和成脂肪分化能力。第二部分:体外构建含人BMP2基因的慢病毒载体并转染USCs,检测转染效率和转染后细胞活力,检测转染对USCs碱性磷酸酶活性(ALP),矿盐沉积和成骨标志物表达的影响,将转染BMP2的USCs移植到裸鼠体内分析其异位成骨能力。第三部分:分离并扩增USCs,将USCs接种至β-TCP支架上,通过扫描电镜,CCK-8和活死细胞染色检测USCs在β-TCP上的粘附、增殖和存活,成骨诱导培养基培养7天和14天后,通过ALP活性和成骨基因表达检测USCs在β-TCP上成骨分化情况。第四部分:将USCs/β-TCP复合物移植到大鼠6 mm股骨缺损处,在术后4、8和12周通过X线,micro-CT以及组织学染色来分析骨缺损的愈合情况。结果:第一部分:5-7 d后在培养板中观察到细胞克隆出现,14 d后可以达到90%的融合。CCK-8证实贴壁细胞增殖活跃,与ASCs一样呈现“S”形增殖曲线。流式细胞仪结果证实USCs和ASCs表达CD29,CD44,CD73,CD90,不表达CD31,CD34,CD45,CD133和HLA-DR。但CD105在ASCs中表达较高,而在USCs中表达较低。USCs可以向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。与ASCs具有同样的多向分化能力。经过体外多次传代后,USCs仍然显示正常的核型。第二部分:流式结果显示慢病毒转染效率高达90%,且转染后细胞增殖未受明显的影响。慢病毒转染BMP2基因到USCs后,BMP2基因表达和蛋白分泌量明显增多,BMP2转染组ALP活性和矿盐沉积明显高于普通USCs和GFP转染组。同时BMP2-USCs高表达成骨相关的标志物:Runx2和OCN,组织学染色分析显示BMP2-USCs移植组在裸鼠肌袋中形成大量的新生骨。第三部分:USCs可以在β-TCP支架上粘附、增殖和存活。ALP活性和成骨相关基因表达证实USCs向成骨细胞分化。第四部分:X线和micro-CT结果证实USCs/β-TCP组修复效果明显优于单纯β-TCP和空白对照组。组织学染色同样证明USCs/β-TCP组新生骨明显多于单纯β-TCP和空白对照组。荧光显微镜显示USCs/β-TCP组矿盐沉积速度明显快于β-TCP和空白对照组。术后12周抗人细胞核抗体证实USCs在骨缺损部位的存活。体内实验结果显示USCs/β-TCP能明显的促进骨缺损的修复。结论:从成人清洁中段尿液中可以分离得到USCs,USCs具有与ASCs类似的生物学特征。BMP2基因转染有效的促进USCs成骨分化。USCs能在β-TCP上粘附,增殖,存活和成骨分化。USCs/β-TCP移植能显著促进骨缺损的修复,USCs可做为骨组织工程的种子细胞。
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of USCs on the bone formation and differentiation of USCs by means of CCK - 8 and flow cytometry . The results showed that USCs were cultured on 尾 - TCP and cultured for 7 days and 14 days . The results showed that the proliferation and survival of USCs were investigated by means of CCK - 8 and flow cytometry . The results showed that USCs / 尾 - TCP groups were significantly higher than that of 尾 - TCP and blank control group . The results showed that USCs / 尾 - TCP group had better effect on bone defects .
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R687

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 王臻;郭征;李靖;卢建熙;陈国景;;多孔磷酸三钙人工骨修复腔隙性骨缺损的随机对照研究[J];中华骨科杂志;2011年06期

2 熊建文;肖化;张镇西;;MTT法和CCK-8法检测细胞活性之测试条件比较[J];激光生物学报;2007年05期

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本文编号：1912344