人类全基因组外显子芯片检测口腔癌单核苷酸多态性的初步研究

【摘要】 目的：通过基于人类全基因组外显子芯片测序技术的全基因组关联分析（GenomeWide Association Studies，GWAS），检测口腔癌患者原发灶组织、其颈淋巴结转移癌组织以及健康志愿者外周血的单核苷酸多态性（Single NucleotidePolymorphisms，SNP）。同时，寻找取口腔癌易感基因以及转移相关基因，为进一步实验打下基础。方法：1、采集10例晚期病人的口腔癌原发灶组织及颈淋巴结转移癌组织以及24个健康志愿者的外周血样本，分别设立为原发灶组、转移组和健康对照组；2、提取样本DNA并在基因芯片上实施全基因组外显子测序；3、测序后，通过样品表Genomestudio可以实现原始数据有选择性的数据提取，进行基因分型数据可视化和简要分析；采用PLINK软件和haploview软件对测序结果进行病例对照组间比较，实现全基因组关联分析（GWAS）；通过卡方检验和多重校正方法比较两组样品基因分型信息，筛选出口腔癌易感基因和转移相关基因的SNP位点（p<0.05为差异有统计学意义）。结果：1、实验成功地实现了共44个样本的基因芯片全外显子测序，包括24个健康志愿者的外周血样本、10例口腔癌病人的10个口腔癌原发灶组织及10个对应的颈淋巴结转移癌组织。2、通过Genomestudio软件实现了测序数据有选择性的可视化和简要分析。3、原发灶组与转移组的比较（10个口腔癌原发灶组织与10个对应的颈淋巴结转移癌组织）、原发灶组与健康对照组的比较（10个口腔癌原发灶组织和24个健康对照）和转移组与健康对照组比较（10个口腔癌颈淋巴结转移癌组织和24个健康对照）的卡方检验结果，经校正后均出现卡方值的p>0.05，没有发现有统计学差异的SNP。4、在口腔癌病例组（10个口腔癌转移癌样本和10个口腔癌原发灶样本）与健康对照组的比较中，从选定的242901个与人类疾病有关联的标签SNP中筛选出了622个SNP位点（未校正前卡方的p<0.005），经过多重校正共同确定了2个SNP位点（exm530670代表NM₀05514、p=0.025，属于染色体6p21.3上人类蛋白质编码基因HLA-B；和exm1415896代表NM₁98534.2、p=0.036，属于人类蛋白质编码基因C19orf45）与口腔癌有高度相关性（Bonferroni adjustion等多重校正后，均得p<0.05）。其中C19orf45被已发表的外文文献证实在肿瘤和人诱导干细胞中发生了突变，而HLA-B被直接证实与头颈部鳞状细胞癌发病和肿瘤转移都存在紧密相关。结论：人类蛋白质编码基因HLA-B和C19orf45与口腔癌存在紧密关联。通过这个初步研究我们掌握了全基因组外显子芯片测序技术和测序结果分析方法，为进一步寻找口腔癌转移相关基因及其功能打下了基础。 

前 言

针对口腔癌的诊断和治疗工作进展，借助 WHO 的说法，有赖于肿瘤研究的发展。有研究认为 u-PA 基因 rs2227564 C/T 多态性与口腔鳞状细胞癌的发生发展有关[1]。而且血管内皮生长因子在+936 T 等位基因－2578 C/A SNP 和（或）其他 SNP 与口腔鳞状细胞癌联系紧密[2]。由于在 MDM2 启动子的单核苷酸多态性能减弱 p53 肿瘤抑制途径并加速人类肿瘤的形成，研究人员提出了以 MDM2 基因SNP309 作为一个肿瘤发生限速事件的肿瘤模型[3]。在由嚼槟榔引起的口腔鳞状细胞癌中 MDM2 基因 SNP 309 和 p53 突变对肿瘤形成起协同作用，MDM2 基因 SNP309 被认为促进了有 p53 缺陷的恶性肿瘤的早期形成。在对另外 351 例由嚼槟榔引起的口腔鳞状细胞癌患者的检查中，发现 MDM2 基因多态性（SNP 309，G 等位基因变异）与体细胞 p53 突变共同增加了口腔癌细胞淋巴结膜外扩散的概率，并与肿瘤患者治疗预后不良有关，因此，认为 MDM2 基因 SNP 309 和 p53 突变对口腔癌进展起协同促进作用[4]。在与烟草有关的口腔癌高风险印度人中，进行患口腔癌风险与 hMLH1 基因启动子单核苷酸多态性的关联研究，科研人员选择 242例与烟草有关的口腔鳞状细胞癌患者和 205 例健康对照者进行基因分型，发现hMLH1-93 A＞G 多态性的印度人患与烟草相关口腔鳞状细胞癌的风险很高，并认为这一基因多态性可以用于口腔癌高风险人群的筛查[5]。因此，基因的变异被认为对口腔癌的发生发展起重要的作用，对口腔癌组织细胞基因的研究就十分有必要。
外显子是人类基因的一部分，包含着合成蛋白质所需要的信息，都是基因功能区序列，而且全部外显子占人类基因组的量不到 2%。外显子测序是利用靶向序列捕获技术将全基因组外显子区域 DNA 捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，实现对外显子序列有针对性检测的基因组分析方法[6, 8, 12]。基因芯片(genechip)又称 DNA 芯片，是通过微加工技术将大量带有已知生物信息的探针分子固定于芯片底板上（通常每平方厘米点阵密度高于 400 基因序列探针分子），然后与人体样品 DNA 分子进行杂交反应，通过反应后杂交信号强度和位置信息的检测进而确定 DNA 分子的生物信息。在生物信息学分析手段的支持和帮助下，外显子组测序读取精度得到了提高，并在致病基因发现中发挥作用[7]。该技术测序精度高，能检测到个别碱基的替换、插入、缺失、拷贝数变异甚至整个外显子组染色体转位[7]。由于基因芯片外显子组测序能有针对性地选择预先指定靶向外显子序列，采用该技术可以低误差、高通量地检测组织细胞基因表达情况，能反映疾病与基因的大量相关关系，并且远比全基因组序列测序更简便、经济、高效，因此是一种疾病基因变异高效分析的策略[6-8]。
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材料与方法

1．1 肿瘤标本和血液标本采集
我们选取患口腔癌并发生口腔癌颈部淋巴结转移的癌者，同时符合未经放、化疗治疗的首次就诊患者，采集口腔癌原发灶组织、转移癌组织标本及相关临床资料。共收集广西医科大学附属口腔医院 10 例口腔癌患者的原发灶组织和转移癌癌组织；以及参与实验的 24 个健康志愿者的外周血标本。使用的所有标本均获得病人的知情同意，并于术前或实验前签署标本使用同意书。所有口腔癌患者均经手术，病理确诊为各种口腔癌并发生颈淋巴结转移。所有组织标本均在手术后 1 小时内分区保存于-80 度低温冰箱中，未经福尔马林固定或石蜡包埋等影响。经过筛选和 DNA 测定，最终选取 10 例口腔癌患者的原发灶组织和转移癌癌组织，做了外显子基因芯片上样；同时成功选取参与实验的 24 个健康志愿者的外周血标本外显子基因芯片上样；整个实验实现了 44 个标本的外显子基因芯片上样，为外显子测序、原始数据的可视化和分析奠定了基础。
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1.2 DNA 样品采集
1.2.1 实验材料
实验仪器：1.5ml 离心管、2mL 的微量离心管、-80℃低温冰箱、水浴锅两个、液氮罐、剪刀、200μL 移液枪及枪头、20μL 移液枪及枪头、离心机（20,000×g (14,000 rpm)）、镊子、振荡器、精密质量电子称、砂浆研钵和研杵、匀化器、摇床、搅拌器、Nano drop DNA 浓度测量仪、260/280 分光光度计。
实验试剂：QIAamp 试剂盒(凯捷 QIAGEN 组织 DNA 提取纯化试剂盒)，AL 缓冲液和 ATL 缓冲液、96-100%乙醇、PBS、蛋白酶 k、 AE 缓冲液、AW1 和 AW2 缓冲液、液氮。
1.2.2 实验方法
一、口腔癌样本 DNA 提取
口腔癌组织标本要求：
1、组织采集后用-80℃急速冷冻（有利于较好保存 DNA，获得较好的 DNA）。
2、组织样品总重量大于 30mg，剪成组织块后但单个组织块重不大于 30mg。准备事项：
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统计学方法......................... 32 
实验结果........................... 32-55 

讨论 

我们的研究成功地发现 622 个人类蛋白质编码基因与口腔癌存在密切关联，其中 HLA-B 和 C19orf45 与口腔癌的关系通过了多重统计学验证，它们可能与口腔癌存在关联，，是我们研究口腔癌新基因最重要的候选基因。目前已经被证实频繁发生突变的头颈部肿瘤基因有 TP53、NOTCH1、CDKN2A、PIK3CA 和HRAS 等[48]，我们的研究拓展了口腔癌的基因谱，增加了 HLA-B 和 C19orf45这 2 个基因，为下一步基因功能验证实验提供研究对象。
在单纯转移癌与原发癌的比较中，GWAS 无法获得校正后有统计学意义的SNP 位点，我们也就无法获知口腔癌从原发灶到转移癌的过程中发生的基因变化（差异没有统计学意义）。这种无统计学意义的结果同样出现在原发灶与健康对照、转移癌与健康对照的比较中，这种结果可能与研究样本量不足有关。同时，GWAS 研究是有缺陷的，它存在人群分层等挑战[30, 47]。GWAS 只是建立在数学相关上，而不是生物学基础的相关，无法证明基因在疾病中的作用[47]；同时，GWAS 得出基因位点与疾病有关或无关，还受人群分层影响[47]。在口腔癌病例组（合并 10 个原发灶和 10 个转移癌）与对照组（24 个外周血样本组）比较后，实验结果出现了有统计学意义的差异，这一现象可能反映了 GWAS 分析受到样品数量等因素的干扰。然而，根据统计学校正结果，我们有理由相信，这两个新发现基因与口腔癌的发病和转移有密切关系的。
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结论

1、通过该实验，我们掌握了人类全基因组外显子芯片测序技术，能检测并分析口腔癌 SNP 信息，为口腔癌的进一步研究提供有力手段。
2、本实验无法直接找到与口腔癌转移相关基因，可能与试验样本量较少有关。
3、实验发现的 HLA-B 和 C19orf45 基因的变异可能口腔癌的发病和转移有关，可以作为进一步研究的候选基因。
人类蛋白质编码基因 HLA-B 和 C19orf45 与口腔癌存在紧密关联。通过这个初步研究我们掌握了全基因组外显子芯片测序技术和测序结果分析方法，为进一步寻找口腔癌转移相关基因及其功能打下了基础。
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参考文献（略）