人髓核细胞分离、传代培养方法的建立及意义

发布时间：2018-05-29 02:14

  本文选题：髓核细胞 + Ⅱ型胶原酶消化法　； 参考：《山东医药》2017年32期

【摘要】：目的建立一种体外分离、培养人髓核细胞(NPCs)的新方法,并探讨其意义。方法采用0.2%Ⅱ型胶原酶消化法分离人正常NPCs,单层贴壁法进行传代培养,倒置显微镜下观察细胞形态。取第1、2、3代NPCs,采用CCK-8法检测细胞增殖能力(以吸光度值表示),连续检测12天。取第2代NPCs,采用免疫组化法检测Ⅱ型胶原(Col-2)、细胞角蛋白18(KRT-18)、KRT-19、低氧诱导因子1α(HIF-1α)、葡萄糖转运子1(GLUT-1)、Sox-9、聚集蛋白聚糖(ACAN)、CD24阳性表达率。结果分离的NPCs呈多角形或短梭形,类似于软骨细胞;第4代以后,NPCs细胞突起延长,呈长梭形,生长缓慢,出现老化现象。NPCs生长曲线呈S形:1~2天细胞生长缓慢;3~7天细胞生长迅速,进入对数生长期;8天后进入平台期,细胞增殖缓慢。连续培养12天,第1、2、3代NPCs相同时间点吸光度值比较差异均无统计学意义(P均0.05)。第2代NPCs中Col-2、KRT-18、KRT-19、HIF-1α、GLUT-1、Sox-9、ACAN、CD24阳性表达率均≥85.6%(85.6%~91.2%)。结论单纯0.2%Ⅱ型胶原酶消化法及单层贴壁法可分离、培养人NPCs,并经免疫组化染色鉴定证实;传代3代以内的NPCs细胞形态及增殖能力均无明显改变,可作为椎间盘退变相关研究的种子细胞。
[Abstract]:Objective to establish a new method for isolation and culture of human nucleus pulposus cells (NPCs) in vitro and to explore its significance. Methods normal NPCs were isolated by 0.2% collagenase digestion and cultured with monolayer adherent method. The morphology of NPCs was observed under inverted microscope. CCK-8 assay was used to detect the proliferative ability of NPCs in the 3rd generation of NPCs. The cell proliferation was measured by absorbance for 12 days. In the second generation of NPCs, immunohistochemical method was used to detect the positive expression rate of CD24 in type 鈪，

本文编号：1949107