复合晚期内皮祖细胞的小肠粘膜下层组织构建小口径人工血管的研究

发布时间：2018-05-30 06:24

  本文选题：内皮祖细胞 + 成血管功能　； 参考：《苏州大学》2015年博士论文

【摘要】：目的 分离、培养、鉴定晚期内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs)。将晚期EPCs,作为种子细胞,研究晚期EPCs的生物学特性。制作小肠粘膜下层组织(small intestinal submucosa,SIS),并作为细胞外基质材料,研究与晚期EPCs在体外共培养的生物相容性,以及EPCs在SIS表面的生长情况。观察复合晚期EPCs的SIS构建的小口径人工血管的性能,以及修复兔颈动脉缺损的实验研究。方法 骨髓单个核细胞分离后以EGM-2MV培养,采用免疫组化、免疫荧光和流式细胞仪鉴定晚期EPCs相关标志CD34、CDl33、VEGFR-2和v WF的表达;Dil-ac LDL和FITC-UEA-1的摄取能力,MTT法绘制晚期EPCs生长曲线;Matigel胶测定晚期EPCs成血管功能;透射电镜观察晚期EPCs向内皮细胞转化的特征。SIS来自于猪的小肠,经过物理和化学的处理制备得到。用光学显微镜观察晚期EPCs在SIS上的生长形态,增殖率通过MTT测定。通过ELISA和免疫印迹法,测定晚期EPCs接种到SIS后生产血管生成素-1(ANG-1)和内皮细胞生长因子(VEGF)的含量。将SIS膜以胶原蛋白和硫酸软骨素混合液粘接,并缝合制作SIS管。体外测试支架爆破压,溶血试验,对凝血时间的影响。接种晚期EPCs,并扫描电镜观察接种情况。移植入兔颈动脉缺损处,定期行彩超和DSA检查观察移植血管的情况。行组织学检查观察移植入的SIS管重塑情况,扫描电镜和荧光显微镜观察血管内皮细胞层情况。结果 早期EPCs呈集落样生长,晚期EPCs表现出鹅卵石形态,纺锤状的形状。晚期EPCs表面抗原标志物CD34,CD133,VEGFR-2,v WF表达为不同程度的阳性;流式细胞仪检测显示早期EPCs的CD133含量较高,后逐渐降低;晚期EPCs的VEGFR-2含量上升。晚期EPCs增殖明显,形成网状连接的管腔样结构。电镜下晚期EPCs可见到内皮细胞特征性细胞器-Weible-Palade(W-P)小体。光镜显示,机械和化学处理的小肠粘膜下层是由细胞外基质组成。晚期EPCs和SIS共同培养后,细胞增殖率明显提高,并能够在SIS上粘附,生长和增殖。共同培养后,ANG-1的分泌量在第1d时就较单纯的晚期EPCs组升高,随着时间的延长逐渐升高,到第7d时分泌量达到最高,后逐渐下降。VEGF的分泌量呈随着时间的延长逐渐升高后,一直稳定在较高的水平。免疫印迹分析进一步表明,晚期EPCs播种到SIS的表面上ANG-1和VEGF均有明显的升高。制作的SIS管有良好的爆破压,能够延长凝血时间,符合医用材料的溶血率试验要求,不会对血细胞造成破坏。接种的细胞能够在SIS管上生长。复合晚期EPCs的SIS管在8w时有50%的通畅率。组织学显示,SIS已经有很好的重塑反应,可见胶原纤维和平滑肌细胞。扫描电镜可见完整的内皮细胞层,部分内皮细胞来源于标记的晚期EPCs。结论 骨髓中存在不同特质的早期EPCs和晚期EPCs,晚期EPCs增殖强,具有成血管能力,能够转化为内皮细胞,有限的实验结果表明,晚期EPCs可能是一个有吸引力的诱导血管新生的候选细胞。SIS与晚期EPCs有良好的生物相容性,能够很好的促进晚期EPCs的生长。制作的SIS管能够符合移植血管的要求,在体内实验中能够很好的和宿主整合,并形成完整的内皮细胞层。
[Abstract]:Objective to isolate, culture and identify advanced endothelial progenitor cells (Endothelial progenitor cells, EPCs). Advanced EPCs was used as seed cells to study the biological characteristics of late EPCs, and to make small intestinal submucosa (small intestinal submucosa, SIS) as extracellular matrix material and to study the biocompatibility of later EPCs in vitro. Sex, and the growth of EPCs on the surface of SIS. Observe the performance of the small caliber artificial blood vessels constructed by SIS combined with late EPCs and the experimental study of the repair of rabbit carotid artery defect. Method bone marrow mononuclear cells were isolated and cultured with EGM-2MV. Immunohistochemistry, immunofluorescence and flow cytometry were used to identify the late EPCs related markers CD34, CDl33, V. The expression of EGFR-2 and V WF; the uptake of Dil-ac LDL and FITC-UEA-1, MTT method to draw late EPCs growth curve; Matigel glue for the determination of late EPCs into vascular function; transmission electron microscopy to observe the characteristics of late EPCs to endothelial cells from the pig's small intestine and prepared by physical and chemical treatment. The growth morphology and proliferation rate of s on SIS were measured by MTT. The content of angiopoietin -1 (ANG-1) and endothelial growth factor (VEGF) was measured by ELISA and Western blot. The SIS membrane was bonded with collagen and chondroitin sulfate, and the SIS tube was sutured. The stent was tested by blasting pressure and hemolysis in vitro. The effect of the test on the time of coagulation. Inoculation of late EPCs and scanning electron microscope. The condition of transplantation into rabbit carotid artery defect was observed by color Doppler ultrasound and DSA examination. The remolding of the transplanted SIS tube was observed by histological examination. The vascular endothelial cell layer was observed by scanning electron microscope and fluorescence microscope. The results were early and the results were early. EPCs showed cobblestone morphology and spindle shape. Late EPCs surface antigen markers CD34, CD133, VEGFR-2, V WF were expressed as positive in different degrees. Flow cytometry showed that the CD133 content of early EPCs was higher, then decreased gradually, and EPCs VEGFR-2 content increased in the late stage. In the late EPCs, the endothelial cell characteristic organelle -Weible-Palade (W-P) corpuscle can be seen under the electron microscope. The light mirror shows that the subcellular matrix of the small intestinal mucosa is composed of mechanical and chemical treatment of the small intestinal mucosa. After the co culture of late EPCs and SIS, the cell proliferation rate is obviously increased, and it can adhere to SIS, grow and increase. After co culture, the secretion of ANG-1 was increased at 1D than in the simple late EPCs group. As the time extended, the secretory amount reached the highest at 7d, and then the secretion of.VEGF gradually decreased with the increase of time and remained stable at a higher level. Western blot analysis further indicated that late EPCs was further indicated by the Western blot analysis. The ANG-1 and VEGF on the surface of the sowing to SIS have an obvious increase. The produced SIS tube has good blasting pressure, can prolong the blood coagulation time, meet the requirement of the hemolytic test of medical materials, not cause damage to the blood cells. The cells inoculated can grow on the SIS tube. The SIS tube of the compound late EPCs has 50% patency rate when 8W. Histology shows SIS has a good remodeling response, visible collagen fiber and smooth muscle cells. Scanning electron microscopy shows a complete endothelial cell layer. Part of the endothelial cells originate from the labeled late EPCs. conclusion that there are early EPCs and late EPCs in the bone marrow of the bone marrow, and the advanced EPCs is strong, and has the ability of angiogenesis and can be transformed into endothelial cells. The limited experimental results show that late EPCs may be an attractive candidate cell for inducing angiogenesis,.SIS has good biocompatibility with late EPCs, and can promote the growth of advanced EPCs. The SIS tube can conform to the requirements of the transplanted blood vessel, and it can be well integrated with the host in the body and form the whole in the body. The endothelial cell layer.
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R654.3

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本文编号：1954269