人羊膜间充质干细胞来源的雪旺氏细胞样细胞移植在皮瓣神经再生中的作用
本文选题：皮瓣 + 人羊膜间充质干细胞 ； 参考：《遵义医学院》2017年硕士论文
【摘要】：目的:通过体外对人羊膜间充质干细胞(human amniotic membrane mesenchymal stem cells,h AMSCs)的分离、培养及鉴定,并在体外诱导分化为雪旺氏细胞样细胞(induce Schwann cells,i SCs),分别观察两种细胞移植对皮瓣神经再生的影响。方法:1)产妇知情同意后采集足月剖宫产羊膜,采用胰蛋白酶/胶原酶二步消化法分离提取h AMSCs,接种48h后予以细胞换液以去除人羊膜上皮细胞,并按同样方法传1~2代,通过差速贴壁方法纯化h AMSCs。流式细胞术和细胞免疫荧光鉴定h AMSCs。2)取P3代生长至第6d的h AMSCs在体外诱导分化为i SCs,诱导分化后,分别取i SCs和P3代h AMSCs做免疫荧光染色检测两组细胞S-100、P75和GFAP的表达;Western blot检测两组细胞S-100、P75和GFAP蛋白的表达;实时荧光定量PCR检测两组细胞S-100、P75和GFAP基因表达;ELISA检测h AMSCs培养6d以及h AMSCs诱导后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF浓度。3)建立大鼠腹壁失神经支配穿支皮瓣模型,分为三组:即h AMSCs移植组(A组)、i SCs移植组(B组)及穿支皮瓣模型对照组(C组),每组25只。取增殖期的P3代h AMSCs和诱导后的i SCs,分别于每只大鼠皮瓣标记处皮下多点注射1×106个相应细胞,C组注射PBS。免疫荧光染色观察神经再生,分别于细胞移植后2d、5d、7d、9d、14d各组取5只动物。结果:1)本实验中采用胰蛋白酶/胶原酶双酶化法可以获得大量增殖稳定的h AMSCs,并利用差速贴壁法可去除大量的人羊膜上皮细胞,获得纯度较高的h AMSCs。h AMSCs原代培养48h后可见细胞贴壁生长,5~6d细胞密度可达到80%~90%。流式细胞鉴定:CD90(99.61%)、CD44(99.64%)、CD73(99.82%)、CD105(91.84%)呈阳性,CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR呈阴性(0.12%)。细胞免疫荧光染色结果显示h AMSCs高表达波形蛋白,未表达CK19。2)免疫荧光染色结果显示i SCs组S-100、P75和GFAP的表达量明显高于h AMSCs组(P0.05);Western blot结果显示i SCs组S-100、P75和GFAP蛋白表达量明显高于h AMSCs组(P0.05);q PCR结果显示i SCs组S-100、P75和GFAP的基因表达量明显高于h AMSCs组(P0.05);ELISA分别检测h AMSCs培养6d以及h AMSCs诱导后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF浓度:可见h AMSCs培养6天后BDNF和NGF均有表达,加入诱导液1后,BDNF和NGF表达量明显降低,随着诱导液2及诱导液3的依次添加,BDNF和NGF的表达量逐渐升高,且浓度明显高于h AMSCs培养6d组,说明在诱导分化过程中分泌了大量的BDNF和NGF,提供了潜在的促进神经再生的营养支持。3)细胞移植后第2d、5d、7d、9d、14d分别行皮瓣组织免疫荧光染色,i SCs移植组再生神经纤维数量和直径均高于h AMSCs移植组。结论:1)胰蛋白酶/胶原酶双酶消化法可获得大量的hAMSCs,通过胰酶消化和差速贴壁法,可获得高纯度的h AMSCs;2)分别通过免疫荧光、Western blot、q PCR及ELISA等方法的鉴定,证明了h AMSCs在体外经过适当的化学因子调节后可诱导分化为雪旺氏细胞样细胞,且在诱导分化过程中释放了大量的促进神经生长的因子;3)h AMSCs和i SCs分别移植到失神经支配的皮瓣模型后均可观察到神经的再生,i SCs通过释放大量的BDNF和NGF,在神经再生数量和直径方面均高于h AMSCs。
[Abstract]:Objective : To investigate the effects of two kinds of cell transplantation on the nerve regeneration of skin flap by means of two - step digestion with trypsin / collagenase . The expression of S - 100 , P75 and GFAP in human amniotic membrane was detected by means of two - step digestion method . The results showed that the expression of S - 100 , P75 and GFAP was significantly higher than that in h - AMSCs ( P0.05 ) . Results : 1 ) The expression of BDNF and NGF was significantly lower than that of h - AMSCs . Conclusion : 1 ) The number and diameter of BDNF and NGF in vitro were significantly higher than that of h - AMSCs . Conclusion : 1 ) The number and diameter of regenerated nerve fibers were higher than that of h - AMSCs .
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R622
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，本文编号：2035050
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