基质金属蛋白酶及其相关抑制剂在异位骨化中的作用及机制研究

发布时间：2018-10-08 14:31

【摘要】：研究背景：异位骨化(Heterotopic Ossification, HO)是指在正常情况下没有骨组织的软组织内形成的新生病理骨组织,其既不是单纯的钙盐沉积,也不同于骨折愈合中的新骨形成。随着人工关节置换的广泛应用以及交通伤导致的高能量创伤数量增加,异位骨化发病率也显著上升,研究表明在没有进行预防性治疗的情况下,异位骨化发生率高达60%-75%,髋臼骨折切开复位内固定术发生率超过60%,脊髓损伤后的发生率为20%-25%,其中约18%-35%出现明显的关节活动受限,闭合性颅脑损伤后异位骨化的发生率为10%-20%,其中约10%产生明显的关节活动受限。HO的发病主要可分为三个阶段：(1)炎性浸润及间充质干细胞分化阶段,(2)软骨细胞,成骨细胞等生长阶段,(3)病理骨组织成熟阶段。早期HO局部有明显肿痛,关节活动受限。晚期由于骨组织形成,导致关节活动限制。其基本病理改变是在纤维结缔组织中,原始细胞增殖活跃伴有丰富的毛细血管网,钙盐沉积,形成骨。成熟的异位骨化具有骨的结构,外层包裹纤维结缔组织,里面是成骨细胞,具有小梁结构及类骨组织,中心是活跃的原始细胞。临床诊断主要依靠X线及CT检查进行诊断。治疗中往往对存在高危因素患者实行预防性治疗如放射治疗、非甾体类抗炎药及二磷酸盐等,然而传统非甾体类抗炎药具有胃肠副作用,给患者带来了伤痛,限制了其应用,同时预防性放疗会导致患者出现癌症几率增加,并干扰正常成骨(如骨折愈合和假体植入后的骨长入),并且治疗后仍有较高的发生率。对于已经形成的异位骨化,临床上有效的治疗方法只有手术切除,因此,对异位骨化的早期诊断可以避免对不出现异位骨化的患者进行过度的预防性治疗。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)家族是一类高度保守的锌离子和钙离子依赖的基因多态性内切蛋白水解酶家族,由中性粒细胞、巨噬细胞、小胶质细胞、星型胶质细胞、神经元和血管内皮细胞等以无活性的酶原形式分泌到细胞外,经过活化后在中性条件下发挥活性。它的表达受即早基因、细胞因子、生长因子的调节,同时很多细胞因子可诱导MMPs的表达,如白介素-1、白介素-6、血小板衍化生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子-B、成纤维细胞生长因子、肿瘤坏死因子-a等,起抑制作用的有干扰素B-1b。 MMPs除在转录水平受到调节外,其活性亦在酶原激活、酶活性的抑制等环节受到调控,不同MMPs之间可能也具有活化作用,MMPs的蛋白水解酶活性受非特异性和特异性抑制剂抑制,非特异性抑制剂包括a2-巨球蛋白、a1-抗胰蛋白酶、巴马斯汀(batimastatBB-1101、BB-94)等。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是一种糖化蛋白酶,参与内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞和基质角质细胞核迁移等,在基质降解、组织重塑、细胞迁移、血管生成、伤口愈合,骨生长等病理生理过程中发挥关键作用,是软骨基质降解中最重要的酶之一,是早期的细胞外基质(ECM)重组的生物标记物。MMP-9表达细胞存在于骨髓中,在骨骼肌缺氧环境下会使MMP-9极大的增强,同时在体外实验显示,间充质干细胞增加毛细血管网的生长,并伴随有MMP-2和MMP-9的升高。基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2)可表达在成骨细胞及部分破骨细胞的细胞质,同时可对骨基质进行降解,并抑制骨质吸收和促进骨重建修复。成骨细胞中分泌MMP-2蛋白的变化过程可反映骨代谢的基本情况,如果血清中MMP-2蛋白水平升高,骨转换的速度也随之增快。组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TMPs)广泛分布于体液与组织中,其来源主要是巨噬细胞和结缔组织,同时纤维细胞以及成骨细胞亦可分泌,MMPs与TIMPs之间保持相对的特异性和功能上的动态平衡。当病理条件下,MMPS与TIMPS间的动态平衡被打破,会使细胞外基质过度分解,出现相对应的病理变化。有研究表明,TIMP-1蛋白可选择性抑制MMP-9蛋白的功能,TIMP-2蛋白可选择性抑制MMP-2蛋白的功能,TIMPs蛋白在细胞外基质代谢过程中对MMP蛋白起到相应的负性调节作用,阻止MMP的活化以及对细胞外基质的降解作用,影响蛋白分解的程度和时间。最近研究认为MMP-9蛋白对异位骨化早期发生有预测作用,本研究通过使用脑创伤大鼠模型合并大鼠跟腱钳夹诱导异位骨化模型,综合比较与MMP-9蛋白同属明胶酶的明胶酶A (MMP-2),以及其抑制剂TIMP-1的变化。通过对血液标本使用ELISA法检测蛋白含量,局部组织进行HE切片、免疫组化染色以及RT-PCR基因相对表达量。分析MMP-9蛋白在异位骨化早期预测作用的特异性以及在局部组织的分泌变化关系,以此了解早期阶段异位骨化局部组织中的相关蛋白变化过程,为研究异位骨化发病机制提供参考依据。第一章 MMP-9在大鼠跟腱异位骨化模型中的动态变化研究[目的]大鼠跟腱切断HO模型是近年来运用较多的HO模型,适用于创伤性HO的相关研究,基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP-9)是一种糖化蛋白酶,由间质细胞,如巨噬细胞、中性粒细胞、毛细血管内皮细胞分泌,参与内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞和基质角质细胞核迁移等,在基质降解、组织重塑、细胞迁移、血管生成、伤口愈合,骨生长等病理生理过程中发挥关键作用。通过观测创伤早期大鼠异位骨化模型中基质金属蛋白酶9的表达变化,探讨MMP-9对预测异位骨化发生的价值。[方法]取4-4.5周龄雄性SD大鼠132只,体重135.0±6.5g,随机分为两组(n=66)。实验组通过钳夹并切断跟腱制备异位骨化模型,对照组仅暴露跟腱。术后观察两组大鼠一般情况,2、3、4、5、6、7、8 d两组各取8只大鼠,取跟腱组织行大体、组织学及免疫组织化学染色观察,取血清及跟腱组织分别行ELISA及RT-PCR检测MMP-9蛋白含量及基因表达。通过两组剩余10只大鼠术后5、10周X线片及术后10周组织学观察结果,诊断异位骨化形成情况。[结果]所有大鼠均存活至实验完成。各时间点对照组大鼠跟腱无明显变化,呈正常跟腱结构；实验组随时间延长,跟腱断端硬度逐渐增加,出现大量不规则结缔组织及软骨细胞,MMP-9免疫组织化学染色呈深染阳性。各时间点实验组MMP-9蛋白含量及基因相对表达量均显著高于对照组(P0.05)；实验组MMP-9蛋白含量及基因相对表达量均总体呈上升趋势(P0.05)。根据X线片及组织学观察结果,术后10周实验组大鼠跟腱组织均发生异位骨化,对照组均无异位骨化发生。[结论]在大鼠跟腱异位骨化早期,MMP-9表达明显升高,提示其对预测异位骨化发生有参考意义。第二章MMP-9,MMP-2,TIMP-1在创伤性异位骨化动物模型中的动态变化研究[目的]大鼠自由落体脑创伤模型是一种较为成熟的脑创伤模型,大鼠跟腱HO模型也是近年来运用较多的HO模型。我们运用这2种模型互相叠加,通过对比是否合并脑创伤,探讨脑创伤对异位骨化的影响。同时对异位骨化早期MMP-9, MMP-2以及TIMP-1的蛋白变化曲线进行研究分析,探讨MMP-9, MMP-2, TIMP-1在异位骨化早期的作用机制以及与异位骨化发生的关系。[方法]取4-4.5周龄雄性SD大鼠264只,体重135.0±6.5g,随机分为四组(n=66)。分别为脑创伤合并跟腱钳夹切断组(A组),脑创伤合并创伤对照组(B组),跟腱钳夹切断组(C组),创伤对照组(D组)。术后1、2、3、4、5、6、7天,分别从4组大鼠随机取8只大鼠进行解剖及标本收集、分析。4组大鼠各留10只于术后5、10周观测动物模型的制备效果。取跟腱组织行大体、组织学及免疫组织化学染色观察,取血清及跟腱组织分别行ELISA及RT-PCR检测MMP-9, MMP-2,TIMP-1蛋白含量及基因表达。通过两组剩余10只大鼠术后5、10周X线片及术后10周组织学观察结果,诊断异位骨化形成情况。[结果]所有大鼠均存活至实验完成。A组与B组大鼠出现行动迟缓,进食减少,体重下降等症状。四组大鼠术后均出现右下肢活动减少,2-3周后恢复正常。A组大鼠术后5周X线片观察,出现高亮阴影100%(10/10),术后10周出现高亮阴影100%(10/10)。B组大鼠术后5周,出现高亮阴影40%(4/10),术后10周出现高亮阴影80%(8/10)。C组大鼠术后5周X线片观察,出现高亮阴影80%(8/10),术后10周出现高亮阴影100%(10/10)。D组大鼠术后5周X线片观察,出现高亮阴影0%(0/10),术后10周出现高亮阴影0%(0/10)。四组动物模型血清MMP-9, MMP-2, TIMP-1蛋白含量及其基因相对表达量均出现升高(P0.05)。A,B,C组大鼠血清MMP-9蛋白含量均高于D组大鼠(P0.05),A组与C组大鼠术后5-7天MMP-9蛋白含量均高于B组大鼠(P0.05)。实验中A、B、C组大鼠MMP-2基因表达量均高于D组(P0.05)。 A、B、C组大鼠TIMP-1蛋白均较D组大鼠升高(P0.05)。A、C两组进行跟腱钳夹的大鼠,TIMP-1基因相对表达量明显较B、D两组升高(P0.05)。从术后5天起,各组大鼠MMP-9敏感曲线面积达到1.0(P=0.001),D组大鼠MMP-9蛋白与TIMP-1蛋白呈正相关(P0.05),A、B、C组大鼠均不具有相关关系。[结论]1.脑创伤会导致大鼠MMP-9与MMP-2在术后早期出现升高；2.脑创伤能使未达到异位骨化发生程度的创伤部位发生异位骨化的病理变化,提高异位骨化的发病率及异位骨化的严重程度：3. MMP-9, MMP-2, TIMP-1这三种蛋白在异位骨化发病过程及创伤修复过程中均起重要作用；4.血清中MMP-9蛋白含量可能与异位骨化的严重程度呈正比,且具有早期预测异位骨化发生的意义；5.血清中MMP-9蛋白含量在术后5-7天诊断异位骨化的敏感性最高；6. TIMP-1蛋白主要与局部组织损伤程度相关,在局部组织主要起保护作用；7.异位骨化的产生与MMP-9与TIMP-1蛋白的平衡失调相关,MMP-9与TIMP-1的表达失调导致细胞外基质出现病理性降解过度。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R681

【共引文献】