Transwell间接共培养条件下成骨细胞向脂肪细胞横向分化的实验研究

发布时间：2018-10-17 13:12

【摘要】：目的:探讨在Transwell间接共培养体系条件下,将成熟脂肪细胞作为诱导因素,观察成骨细胞成脂横向分化的可能性,为下一步进行体内实验和进一步临床治疗提供参考。方法:1.将3T3-L1小鼠成纤维样前体细胞传至3代,选取对数期的细胞加入成脂诱导液培养10d,用油红O染色鉴定其为成熟脂肪细胞后,将成熟脂肪细胞作为诱导因素来诱导成骨细胞。传代至第3代的MC3T3-E1小鼠成骨样细胞设立为实验组。选取上室下室面积之比为1:4,插入式Transwell培养板,将实验组细胞和小鼠成熟脂肪细胞组细胞分别种于Transwell体系的上室和下室,并记为0d,对照组为用低糖DMEM单独培养的MC3T3-E1小鼠成骨样细胞。2.油红O染色实验检验实验组和对照组7d、14d、21d 3个时间点的脂滴染色情况;3.茜素红染色检验实验组和对照组细胞在7d、14d、21d 3个时间点钙化结节量的表达情况;4.以脂肪条件培养基(FCCM)培养基及低糖DMEM培养基分别培养小鼠成骨样细胞,以MTT法在0h、24h、36h 3个时间点检测实验组与对照组的细胞增殖抑制率;5.检测实验组和对照组细胞在7d、14d、21d 3个时间点甘油三酯(TG)相对含量表达;6.Western blot检测各组细胞在7d、14d、21d 3个时间点成脂目的蛋白PPARγ2的表达含量。7.数据统计采用SPSS19.0软件分析,使用方差分析进行组内及组间的差异性比较、分析,以α=0.05作为检验标准,实验结果以均数±标准差(±s)表示,P0.05表示差异有统计学意义。结果:1.镜下观察结果:成脂诱导培养10d,前体脂肪细胞的形态由成纤维样变为圆形,胞质内脂滴聚集,经油红O染色后,鉴定为成熟脂肪细胞;实验组细胞共培养7d细胞呈长梭形,细胞内未见脂滴,14d时细胞呈成纤维样,胞质内逐渐出现黑色颗粒物质及少量脂滴,培养至21d,部分细胞由成纤维样变为椭圆形或圆形,胞质内脂滴增多;对照组细胞胞质内容及细胞形态未有明显改变;2.油红O实验结果显示实验组细胞染色区呈递增趋势,对照组细胞染色区无明显变化;3.茜素红染色结果显示实验组细胞自7d、14d、21d呈钙结节量表达减少的趋势;对照组细胞在3个时间点则无明显变化,呈大片着色区;4.MTT法检测结果显示:实验组抑制率分别为0h组(0.1947±0.09)%、24h组(64.917±2.4)%、36h组(71±2.3)%,对照组抑制率为0h组(0.1735±0.05)%、24h组(23.33±3.4)%、36h组(56.33±1)%,实验组与对照组相比及实验组组间比较差异有统计学意义(P0.05),对照组组间比较差异有统计学意义(P0.05);5.TG相对含量检测结果显示实验组细胞甘油三酯聚集量呈递增趋势,随时间的增长而增多,实验组TG表达量为7d组(0.20167±0.015)、14d组(0.25167±0.024)、21d组(0.58167±0.023),对照组的表达量为7d组(0.22±0.027)、14d组(0.19667±0.025)、21d组(0.24±0.042),在3个时间点实验组组间相比及实验组与对照组相比差异有统计学意(P0.05),对照组组间比较无统计学意义(P0.05);6.Western blot实验结果显示:实验组细胞PPARγ2蛋白表达量在3个时间点呈递增趋势,实验组目的蛋白表达量为7d组(0.245±0.012)、14d组(0.40817±0.0365)、21d组(0.759±0.039),对照组的表达量为7d组(0.2781±0.043)、14d组(0.2955±0.022)、21d组(0.3849±0.03),而成熟脂肪细胞的目的蛋白表达量为7d组(0.9905±0.32)、14d组(1.1259±0.65)、21d组(0.98999±0.25),实验组组间相比,实验组与成熟脂肪细胞组相比,以及实验组与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:1.在Transwell间接共培养体系中,成骨细胞在成熟脂肪细胞诱导下呈现出成脂横向分化趋势,脂肪目的蛋白PPARγ2表达量与时间成正比,钙结节量与时间成反比;2.实验组成骨细胞与成熟脂肪细胞相比,目的蛋白PPARγ2表达量有明显差异,实验组细胞是否完全横向分化为成熟脂肪细胞有待下一步考证;3.FCCM条件脂肪细胞培养基能明显抑制成骨细胞的增殖能力。
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【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R68

【参考文献】