MicroRNA-10a-3p在后纵韧带骨化中的作用及调控机制研究

发布时间：2018-10-26 15:31

【摘要】：【研究背景与目的】后纵韧带骨化(Ossification of posterior longitudinal ligament,OPLL)是常见的脊柱疾患,指脊柱韧带的异位骨化形成,骨化的后纵韧带压迫脊髓,易引起患者四肢与躯干感觉、运动及括约肌功能障碍,甚至导致四肢瘫痪和大小便失禁,是一种严重危害人类健康的疾病。OPLL发病具有种群特异性,文献报道该疾病在东亚国家发病率较高,目前尚无单一的发病机制证据,学者认为遗传因素在OPLL的发生发展中起到了重要作用,所以探寻OPLL特异性基因改变及调控网络尤为重要。目前许多成骨相关基因被报道与OPLL的发展密切相关,它们的上游调控因子似乎在OPLL的特异性调节机制中起重要作用。而micro RNA(miRNA)是值得探索的一个因素。文献报道miRNA不但可以调控多种基因的表达,甚至可以改变细胞的状态,其作为一种重要的转录后调控方式,参与了人类近1/3的基因表达过程,在生长发育、免疫应答、肿瘤发生等方面具有广泛的作用。miRNA具有非常复杂的调控网络,研究发现多种疾病中均存在miRNA的差异表达。为了破译OPLL的上游调控网络,我们拟利用高通量测序和生物信息学技术的优势,对后纵韧带骨化韧带细胞和正常后纵韧带细胞差异表达的miRNAs进行分析,进一步挖掘其在后纵韧带细胞成骨分化中的功能,明确差异表达miRNA对后纵韧带细胞成骨分化的影响。已有很多文献报道miRNA可以调节许多细胞的成骨分化的进程,而且这些成骨过程受miRNA精确调控,这使miRNA调节成为骨形成过程的上游关键因子。因此,OPLL患者中差异表达的miRNA影响下游的某些骨化相关因子的激活或抑制,韧带骨化的进程中也同样受到了影响。随之而来的问题是,上述差异表达miRNA对后纵韧带细胞的促进/抑制成骨作用是通过哪些中间的信号通路导致的呢?带着这些疑问,我们设计了如下细胞实验及动物试验,以期在体外及体内环境探究OPLL发生发展的上游调控因子及其调控网络,为OPLL的诊治提供理论依据。第一部分:高通量测序筛选后纵韧带骨化韧带细胞中差异表达的miRNAs方法:(1)后纵韧带细胞体外培养;(2)样本总RNA抽提及分离;(3)小RNA文库的构建及高通量测序;(4)miRNA差异表达分析;(5)GO和KEGG显著性富集分析;(6)差异表达miRNA的验证。结果:(1)术中所取标本培养2周左右,组织块周围有细胞萌出,细胞呈长梭形,较瘦小,排列紧密;(2)原始序列经过处理后,2组样本所获得的可用于分析的小RNA序列数量分别为2066542和1833901条。序列长度主要集中在18~22nt,说明获得的序列质量较高;(3)测序结果差异大于2倍的miRNAs有218个,包括144种上调的miRNAs和74种下调的miRNAs,差异大于4倍的miRNAs有154个,差异大于8倍的miRNAs有52个;(4)我们应用GO分析,共65个显著性(P0.01)GO术语与上调基因相关,发现OPLLCs比PLLCs表达更多的骨化相关基因;(5)real-time PCR验证差异表达的miRNAs与高通量测序结果基本一致。结论:我们使用下一代测序技术(NGS)来评估miRNA和m RNA中的表达变化。发现了以miR-10a-3p为代表的大量差异表达的miRNAs,real-time PCR的结果也证实了与高通量测序结果一致的miRNA表达变化,这些差异表达的miRNA可能参与OPLL的发生和进展,并为OPLL诊断或治疗提供了新的靶标。第二部分:miR-10a-3p对后纵韧带细胞的促成骨作用方法:(1)利用转染试剂进行后纵韧带细胞的瞬时转染,并对后纵韧带细胞诱导成骨分化;(2)碱性磷酸酶染色方法和茜素红染色方法对后纵韧带细胞进行成骨能力检测;(3)利用western blot对待测样品中目的蛋白的表达水平进行定量分析。结果:(1)过表达miR-10a-3p促进PLLCs成骨分化;(2)抑制miR-10a-3p后抑制OPLLCs成骨分化。结论:过表达miR-10a-3p后能够提高PLLCs的骨化诱导水平,增强后纵韧带细胞碱性磷酸酶的活性及钙质的沉积,而抑制miR-10a-3p后,其相应成骨分化进程受到抑制,说明miR-10a-3p在后纵韧带细胞的成骨分化过程中起到了重要作用,其在OPLL患者中高表达可能发挥了其促进韧带骨化的作用。第三部分:miR-10a-3p促进后纵韧带细胞成骨分化的机制研究方法:(1)采用Targetscan 6.0并利用GO和KEGG功能显著性富集分析miR-10a-3p的潜在靶基因;(2)萤光素酶报告基因实验验证靶基因;(3)Ch IP分析miR-10a-3p靶基因下游通路。结果:(1)预测miR-10a-3p的靶基因为ID3和HAND2;(2)PLLCs中过表达miR-10a-3p可在一定程度上降低ID3的表达,在OPLLCs中抑制miR-10a-3p,可以显着增加ID3的表达;(3)Ch IP分析miR-10a-3p过表达后,RUNX2与OCN和ALP的结合在PLLCs中显着增加,而在OPLLCs中抑制miR-10a-3p后,RUNX2与OCN和ALP的结合显着降低。结论:通过预测miR-10a-3p的靶基因并进行验证,我们最终发现其可能靶基因为ID3,Ch IP分析结果显示miR-10a-3p可通过靶向ID3主动调节韧带细胞的骨化水平,从而促进RUNX2与骨化相关基因结合,促进OPLL的发生发展,在体外验证了PLL和OPLL韧带细胞中miR-10a-3p发挥作用的功能和机制。第四部分:在体研究miR-10a-3p促进后纵韧带骨化方法:(1)将过表达miR-10a-3p的稳定细胞株和骨胶原支架共孵育,并进行成骨诱导分化;(2)使用micro-CT进行样本分析,计算骨矿物质密度(BMD,mg/cc)和新骨体积与现有组织体积的比例(BV/TV);(3)HE染色和免疫组化分析验证体外实验结果。结果:(1)OPLL韧带细胞在体内具有很强的成骨能力;(2)miR-10a-3p在体内具有促进后纵韧带细胞成骨的作用;(3)HE染色显示,在OPLL细胞处理组(抑制miR-10a-3p)中形成了比其他细胞类型组更大的骨细胞缺陷范围和更有组织的细胞外基质层状骨。PLL组中过表达miR-10a-3p导致更大的层状骨形成,而OPLL组中抑制miR-10a-3p导致骨形成减少,OCN处理的免疫组化结果显示,过表达miR-10a-3p导致更多的阳性染色细胞,而抑制miR-10a-3p导致阳性染色细胞减少。然而,ID3在抑制miR-10a-3p后显示更多的阳性染色细胞,而过表达miR-10a-3p后显示较少。结论:miR-10a-3p不仅在简单的体外环境对后纵韧韧带细胞的成骨分化具有重要作用,在复杂的生物活体条件下,miR-10a-3p对ID3的负向调控作用也得到了证实。小结随着高通量技术的发展和应用,近年来大大扩展和鉴定了miRNA的存在,本课题通过高通量测序技术并结合生物信息学分析方法,找出了后纵韧带骨化中差异表达的miRNA和可能的靶基因。在我们的研究中,我们结合韧带细胞的体外成骨分化诱导以和体内骨形成测定,发现miR-10a-3p在后韧带细胞的成骨分化中起重要作用,并表明miR-10a-3p的靶基因ID3在PLL和OPLL之间表达存在明显差异,使其和miR-10a-3p成为可能的配对功能组合,在OPLL的发生发展中发挥积极作用。我们通过在PLLCs中过表达miR-10a-3p并在OPLLCs中抑制其表达,结果显示miR-10a-3p可通过靶向ID3主动调节韧带细胞的骨化水平,从而促进RUNX2与骨化相关基因的结合。体内试验也得出了同样的结论,我们确定了OPLL发生发展的上游调节因子,认为miR-10a-3p通过ID3/RUNX2轴发挥其功能,并且首次揭示miR-10a-3p/ID3/RUNX2轴在OPLL中的重要作用。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R681.5

【参考文献】