低浓度过氧化氢诱导人脐静脉内皮细胞体外血管生成的机制研究

发布时间：2018-10-31 06:43

【摘要】：目的:通过研究低浓度过氧化氢(H2O2)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移、管腔形成等功能的影响,明确低浓度H2O2对HUVECs体外血管生成能力的生物学效应,进而探讨介导上述效应的分子机制,为促进临床移植组织术后血管生成、增强移植物与受区之间血运重建、改善移植物存活揭示新的治疗靶点。方法:第一部分低浓度H202对HUVECs体外血管生成效应的探讨。①HUVECs体外培养与鉴定;②流式细胞仪分析不同浓度H202对HUVECs活性的影响,确定后续实验所用H202浓度;③通过CCK-8试验、细胞划痕愈合试验及Matrigel管腔结构形成试验分析50μmol/L H2O2对HUVECs增殖、迁移及管腔形成能力的影响;④western blot分析50μmol/L H2O2对HUVECs中ERK5的活化效应。本部分试验结果表示为均数±标准差(x±SD),利用单因素方差分析行多组间比较,利用SNK事后检验行进一步两两比较,P0.05为有统计学差异。第二部分 ca-MEK5、ERK5 shRNA真核表达载体构建及稳转细胞株建立。①ca-MEK5真核表达载体构建。构建人ca-MEK5过表达慢病毒载体,转染293T细胞后western blot检测Flag标签的表达情况,确认表达后包装慢病毒并感染HUVECs;②ERK5 shRNA真核表达载体构建。根据人ERK5基因序列设计并构建shRNA载体,分别包装慢病毒并感染HUVECs, real-time PCR和western blot检测目的基因表达情况,筛选干扰效率最高者进行后续实验;③ca-MEK5、ERK5shRNA稳转细胞株筛选及鉴定。第三部分低浓度H2O2促进HUVECs体外血管生成的分子机制研究。①CCK-8试验、细胞划痕愈合试验及Matrigel管腔结构形成试验分析不同细胞接受50μmol/LH202刺激后,在增殖、迁移及管腔结构形成能力方面的变化;②real-time PCR检测不同细胞中VEGF mRNA水平;③ELISA法检测不同细胞培养上清中VEGF浓度。本部分试验结果表示为(x±SD),统计方法同第一部分。结果:第一部分①HUVECs在含10%FBS及1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中单层贴壁生长,汇合度接近100%时呈典型铺路石/鹅卵石样,内皮细胞特异性表面标记CD31阳性;②不同浓度H2O2作用30min后,与对照组相比,25μmol/L、50μmol/L组细胞均无明显凋亡,1 00μmol/L组细胞凋亡率有所上升,200μmol/L组细胞凋亡率显著增加(P0.05),将细胞较高的耐受浓度(50μmol/L)确定为后续实验浓度;③与对照组相比,50μmol/LH202作用组HUVECs增殖、迁移及管腔结构形成显著增强,过氧化氢酶Catalase可消除H2O2前述促血管生成作用;④与对照组相比,50μmol/L H2O2作用组HUVECs中p-ERK5水平显著升高(P0.05)。第二部分①成功构建ca-MEK5慢病毒载体,MOI20时,HUVECs感染效率约为60%;②成功构建并筛选ERK5shRNA慢病毒载体,MOI20时,HUVECs感染效率约为70%;③两种载体均携带嘌呤霉素抗性及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,使用含嘌呤霉素培养基筛选培养14天后,表达GFP的细胞比例均达90%以上;稳转株鉴定结果显示:ca-MEK5过表达稳转株Flag标签表达阳性,ERK5mRNA及蛋白水平无明显变化,p-ERK5蛋白水平显著增高(P0.05); ERK5 shRNA1稳转株中ERK5 mRNA及蛋白水平、p-ERK5蛋白水平均显著降低(P0.05):相应对照细胞中ERK5、p-ERK5蛋白水平均无显著变化。第三部分①细胞的增殖、迁移及管腔结构形成(vs相应对照组):50μμmol/LH2O2作用组HUVECs显著增强(P0.05),ca-MEK5转染组进一步增强(P0.05),ERK5 shRNA转染组显著减弱(P0.05);②细胞中VEGF mRNA水平(vs相应对照组):50 μmol/L H2O2作用组HUVECs显著上升(P0.05),ca-MEK5转染组进一步升高(P0.05),ERK5 shRNA转染组显著降低(P0.05);③细胞培养上清中VEGF水平(vs相应对照组):50μmol/L H2O2作用组HUVECs显著上升(P0.05), ca-MEK5转染组进一步升高(P0.05), ERK5 shRNA转染组显著降低(P0.05)。结论:低浓度H202 (50μmol/L)能够促进HUVECs的增殖、迁移及管腔结构形成,ERK5为介导H2O2上述促进HUVECs体外血管生成效应所必需。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R622

【参考文献】