医用钛合金（Ti6Al4V）表面石墨烯涂层的制备及生物化研究

发布时间：2018-11-03 18:23

【摘要】：研究背景可控的热机械加工技术使得钛合金拥有诸多优良的机械性能如较低的弹性模量、抗腐蚀性、较高屈服强度等,被广泛应用于骨科、口腔科如人工骨、人工关节、接骨板、螺钉、牙种植体等硬组织的替代材料。目前,使用最多的钛基金属植入物材料是α-β钛合金Ti_6Al_4V,约占所有钛合金制品的80%。钛合金(Ti_6Al_4V)的弹性模量(110 GPa)比骨的弹性模量(10-30 GPa)高。但是,作为一种能植入人体的生物医学材料,首先要考虑的是抗腐蚀性,其次才是机械性能。钛合金极易被氧化,表面会形成一层致密坚固的Ti O2薄膜,这种特性使得钛合金基底具备了较好的抗腐蚀性,也让钛合金作为人体内植入物具有一定的优势。植入成败与否的关键因素除了植入材料自身机械性能和结构特点外,还包括材料的表面特性,如生物相容性和抗腐蚀性等。这些表面特性能间接影响应力遮挡、磨损碎片或疲劳损伤等机械性能。尤其对于用于人体的植入物来说,表面的生物相容性和生物活性起着至关重要的作用,因为表面才是植入物与生物体直接接触的部分。表面工程的目的不仅仅是避免植入材料对周围组织造成负面影响,更重要的是增强内植物与生物体之间的相互作用。活体组织有不断自我恢复和更新的能力,植入材料通常缺乏这个能力。最好的情况是,植入材料的物理和化学特性与植入部位或被取代组织的特性一致。植入物材料和机体组织的界面反应常常决定着植入成功与否。钛合金形成的这层具有着生物惰性的Ti O2薄膜会形成纤维包裹阻碍植入物与机体组织的直接结合。植入骨组织后会造成早期骨形成效果差,远期骨整合不理想。解决这个问题的关键在于保留植入材料机械性能的同时又能让植入物的表面有类似基质的功能充分诱导骨组织再生,使得植入物与骨组织之间形成牢固的骨结合。因为这个原因,近年来通过表面修饰来提高内植物表面的生物活性,进而促进骨整合成为生物材料工程研究的热点。其中最直接有效的方法是利用表面涂层技术在内植物表面加载生物活性物质或药物,达到改善表面生物活性和生物相容性的目的。如通过特殊的金属表面涂层技术,将具有骨诱导活性的材料附着到钛合金的表面。经过表面改性的钛合金植入体内后,可增强成骨细胞功能,从而加速植入物周围骨组织再生及骨形成,进一步提高植入物-骨界面的结合强度,促进钛合金植入物与骨组织的整合程度。石墨烯是2004年由英国曼彻斯特大学的安德烈?海姆团队采用简单的机械剥离的方法从石墨中分离出来并能稳定存在的物质。作为碳元素的同素异形体,石墨烯是以SP2杂化轨道连接而成的一种单原子层厚的二维原子晶体,以长为0.142nm的碳-碳键共价结合。石墨烯是具有不同几何形状石墨材料的基本组成单位,包裹成球形结构会形成零维的富勒烯;卷成桶状结构就形成了一维的碳纳米管(CNTs);叠加成为板层状结构就形成了三维的石墨。石墨烯拥有众多独特的物理化学特性,包括高电子传导能力(室温下为:15,000 cm-1/V?s),优良的导热性(5000 W/m?K),高比表面积(2630 m Z/g)和优秀的力学特性(弹性模量为:1 TPa),是已知材料中强度最大的物质(130 GPa)等。这些特性使石墨烯成为各个领域的科学家们探索新型电子和复合材料道路上的一种“明星材料”,被广泛应用于包括量子物理,单分子气体检测,透明导电电极,纳米工程复合材料和储能装置如超级电容器和锂离子电池等领域。自2008年来,石墨烯在生物医学领域和组织工程方面的研究日益广泛。有大量的研究表明,石墨烯及其衍生物能赋予植入物和生物支架诱导BMSCs粘附、增殖和分化的能力。在医学领域中石墨烯也有广泛的应用前景,如癌症治疗、微生物检测、疾病诊断、药物/基因载体、抗菌材料、生物传感器、生物成像等。因此,石墨烯可以作为一种生物相容性好的涂层材料应用于表面工程及医学领域。本研究中,我们通过制备Ti_6Al_4V表面的石墨烯涂层,利用体外细胞实验及动物体内实验,观察并分析石墨烯对钛合金Ti_6Al_4V表面活性和生物相容性的影响。探索石墨烯作为一种新型纳米涂层材料,增强骨髓基质干细胞的粘附、增殖和成骨分化,促进植入物-骨界面的新骨形成和骨整合的可行性。研究目的1、制备石墨烯表面涂层,并对石墨烯涂层和无涂层的两组Ti_6Al_4V支架进行表征分析。2、利用体外细胞实验,研究石墨烯涂层和无涂层的两组钛合金Ti_6Al_4V支架对骨髓基质干细胞粘附、增殖和成骨分化的影响,明确石墨烯涂层对钛合金支架的生物活性的作用。3、建立新西兰大白兔股骨髁部骨缺损模型,利用体内实验评价两组钛合金支架植入兔子体内后对骨形成和骨整合的效果,明确石墨烯涂层对钛合金支架生物相容性的作用。研究方法1、利用膜转移法,将铜基底上石墨烯导电膜(石墨烯覆盖率为100%)通过化学蚀刻、物理吸附等方法转移至钛合金Ti_6Al_4V的表面制备石墨烯涂层。选用钛合金的规格为:Ti_6Al_4V片(Φ=10mm,δ=5mm)用于体外实验。Ti_6Al_4V棒(Φ=5mm,L=10mm)用于体内实验。利用扫描电镜(SEM)观察表面形态的改变;拉曼光谱仪验证是否有石墨烯特征性波峰的存在;光学接触角测量仪、光学轮廓仪检测支架表面亲水性和粗糙度的改变;利用机械力学压缩试验检测石墨烯涂层对钛合金力学性能的影响;利用超声震荡检测涂层与基底的结合强度。2、体外实验:选用SD大鼠的骨髓基质干细胞(BMSCs),采用全骨髓贴壁培养法进行细胞的分离及培养并分别接种于两组支架上(G-Ti_6Al_4V和Ti_6Al_4V)。接种1、3、5、7天利用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)评价细胞增殖;SEM观察两种支架上的细胞形态和生长状态;接种1、3、5天后进行免疫荧光染色并利用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察并分析两组支架上细胞粘附的情况;接种1、3、5、7天后利用活死细胞试剂盒评估两种支架对细胞活性的影响;成骨诱导21天后,进行茜素红-S染色,定量分析矿化钙结节;成骨诱导7、14天利用ALP活性测定试剂盒定量分析两组支架上ALP的活性,并利用实时定量RT-PCR和Western Blot检测相关成骨基因的表达。3、体内实验:选用新西兰大白兔并建立股骨髁部缺损的动物模型,分别植入两种支架(G-Ti_6Al_4V和Ti_6Al_4V)。选用4、12、24周作为观察时间点,利用Micro-CT,骨组织四环素-钙黄绿素荧光双标、Van-Gieson染色评价两组支架对于骨再生及整合的效果。研究结果1.SEM及拉曼光谱结果显示钛合金Ti_6Al_4V表面的石墨烯涂层制备成功,涂层稳定;接触角测定结果表明G-Ti_6Al_4V组的亲水性明显提高(P0.05);表面粗糙度结果显示G-Ti_6Al_4V组的表面粗糙度明显增高(P0.05);压缩试验结果反映石墨烯涂层对钛合金Ti_6Al_4V整体的力学性能无明显影响(P0.05)。2.体外实验中,细胞计数CCK-8结果显示:与Ti_6Al_4V支架比较,G-Ti_6Al_4V支架在细胞接种1、3、5、7天时促进BMSCs增殖能力更强(P0.05);SEM观察结果显示:在细胞接种1、5天时,G-Ti_6Al_4V支架上的细胞形态更好,细胞伸展程度更好而且细胞数目和丝状伪足也更多;CLSM结果显示:在细胞接种1、3、5天时G-Ti_6Al_4V支架上的细胞粘附斑蛋白(vinculin)较之Ti_6Al_4V组表达更强,平均积分荧光强度(IOD)更高(P0.05);活死细胞染色结果表明:在细胞接种并培养至1、3、5、7天后,两组支架上的活、死细胞数都随时间延长而增多,但在每个时间点G-Ti_6Al_4V组活细胞更多(P0.05);茜素红-S染色及定量结果显示:接种在G-Ti_6Al_4V支架上的BMSCs经过21天的诱导成骨后,钙结节生成量明显高于Ti_6Al_4V组(P0.05);ALP活性定量检测结果表明:在成骨诱导7、14天时,G-Ti_6Al_4V组ALP染色更深,通过ALP定量试剂盒测出的OD值更高(P0.05);实时定量RT-PCR结果显示:与Ti_6Al_4V组相比,G-Ti_6Al_4V组Runx2、ALP、Col-1、BMP-2的表达量在成骨诱导7、14天明显增高(P0.05)。OCN的表达量在诱导第7天时两组比较没有明显差异(P0.05),但在第14天时G-Ti_6Al_4V组的表达量明显增高(P0.05)。Western Blot表现出与RT-PCR相类似的结果。3.体内实验中,生物力学(推出试验)检测的结果显示:在4、12、24周,G-Ti_6Al_4V组和Ti_6Al_4V组最大失效载荷(最大推出力)都随植入时间的延长而增加,但在每个时间点G-Ti_6Al_4V组所需要的最大失效载荷即最大推出力明显高于Ti_6Al_4V组(P0.05);Micro-CT结果显示,在4、12、24周,G-Ti_6Al_4V组的BV/TV、Tb Th和Tb N均明显高于Ti_6Al_4V组(P0.05);4周时,两组的BS/BV结果无差异(P0.05),而在12周和24周时Ti_6Al_4V组的BS/BV则明显高于G-Ti_6Al_4V组(P0.05)。在每个时间点,Ti_6Al_4V组的Tb Sp均高于G-Ti_6Al_4V组(P0.05);骨组织四环素和钙黄绿素荧光双标结果显示:G-Ti_6Al_4V组的骨矿化沉积率(MAR)更高(P0.05);VG组织学染色结果显示与Micro-CT结果类似的趋势,随着植入时间的延长,两组的新生骨量都在增加,但是每个时间点G-Ti_6Al_4V组的新生骨量和新生骨的密度明显多于Ti_6Al_4V组,尤其在第24周G-Ti_6Al_4V组中,骨与植入物之间基本无空隙和纤维组织,骨整合效果更佳。研究结论1、钛合金Ti_6Al_4V表面的石墨烯涂层制备成功,石墨烯涂层与钛合金基底稳定结合。石墨烯涂层增加了Ti_6Al_4V支架表面的亲水性和表面粗糙度但没有改变其力学性能。2、体外细胞学实验表明Ti_6Al_4V支架经石墨烯涂层后,其表面生物活性得到增强,能明显促进BMSCs粘附、增殖及成骨分化。3、石墨烯修饰提高了Ti_6Al_4V支架的生物相容性,将其植入骨隧道后能够促进周围新骨的生成以及新生骨与Ti_6Al_4V支架的结合,提高了Ti_6Al_4V支架表面的骨整合效果,促进了术后骨缺损的修复。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08;R68

【参考文献】