脑源性神经营养因子对人脂肪干细胞增殖与成骨分化的作用

发布时间：2018-11-08 14:25

【摘要】：目的1.了解BDNF高亲和性受体TrkB与低亲和性受体p75NTR于hASCs表达情况。2.明确不同浓度的BDNF对hASCs增殖及细胞周期相关基因影响。3.分析不同浓度的BDNF对hASCs ALP活性及成骨分化相关基因影响,探讨BDNF在hASCs成骨分化过程中的作用。方法1.以胶原酶消化分离hASCs,贴壁培养并传代纯化。对hASCs进行流式细胞术检测,诱导成脂、成骨分化,并进行染色,以对间充质干细胞特性进行鉴定。2.以免疫荧光双染法检测TrkB受体与p75NTR受体于hASCs表达情况。3.以含不同浓度BDNF的无血清培养基培育hASCs,分别于12h.24h.48h以MTT法检测hASCs增殖能力变化,并于48h时收集细胞,real-t ime PCR检测c-myc、ki-67表达水平。4.以含不同浓度BDNF的成骨诱导培养基培育hASCs,于成骨诱导14d时检测hASCs的ALP活性变化,并于成骨诱导3d、7d、14d时收集细胞,real-time PCR检测成骨标志基因Runx2、ALP、OCN表达水平。结果1.hASCs表达间充质干细胞表面标志,不表达造血干细胞表面标志,在体外经诱导可向成脂、成骨方向分化。2.检测结果发现hASCs表达TrkB受体,但未见明显p75NTR受体表达。3.BDNF可促进hASCs增殖,上调c-myc、ki-67表达,具有浓度依赖性(尸0.05)。4.随BDNF浓度增高,ALP活性呈下降趋势,以100ng/ml组抑制效果最显著(P0.05)。成骨7d时,ALP随浓度增加出现下降趋势；成骨14d时,Runx2、ALP、OCN均随处理浓度增加出现下降,于100ng/ml组下降最显著(P0.05)。结论采用酶消法与贴壁筛选法纯化细胞可有效分离hASCs；高浓度BDNF可促进hASCs增殖但抑制其向成骨分化。
[Abstract]:Objective 1. To investigate the expression of BDNF high affinity receptor (TrkB) and low affinity receptor (p75NTR) in hASCs. 2. To determine the effects of different concentrations of BDNF on hASCs proliferation and cell cycle related genes. 3. 3. The effects of different concentrations of BDNF on hASCs ALP activity and osteogenic differentiation related genes were analyzed, and the role of BDNF in the process of hASCs osteogenic differentiation was discussed. Method 1. HASCs, adherent culture was digested by collagenase and purified by passage. The characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) were identified by flow cytometry (FCM), adipogenesis, osteogenic differentiation and staining. 2. The expression of TrkB receptor and p75NTR receptor in hASCs was detected by immunofluorescence double staining. HASCs, was cultured on serum-free medium containing different concentrations of BDNF. The proliferative ability of hASCs was detected by MTT method in 12h.24h.48h, and the cells were collected at 48 h. The expression of c-mycnki-67 was detected by real-t ime PCR. The changes of ALP activity of hASCs were detected on the 14th day of osteogenesis induced by hASCs, cultured in osteoblastic induction medium with different concentrations of BDNF, and the expression level of Runx2,ALP,OCN gene of osteoblast marker was detected by real-time PCR at 3 days, 7 days and 14 days after osteogenesis induction. Results 1.hASCs expressed mesenchymal stem cell surface markers, but did not express hematopoietic stem cell surface markers. The results showed that hASCs expressed TrkB receptor, but no significant expression of p75NTR receptor. 3.BDNF could promote the proliferation of hASCs and up-regulate the expression of c-myccnki-67 in a concentration-dependent manner. 4. With the increase of BDNF concentration, the activity of ALP decreased, especially in 100ng/ml group (P0.05). At 7 days of osteogenesis, ALP decreased with the increase of concentration, while at 14 days of osteogenesis, Runx2,ALP,OCN decreased with the increase of treatment concentration, which was the most significant in 100ng/ml group (P0.05). Conclusion the method of enzyme digestion and adherent screening can effectively isolate hASCs; high concentration BDNF, which can promote the proliferation of hASCs and inhibit its osteogenic differentiation.
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R622

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本文编号：2318743