MiR-340靶向EZH2逆转miRNAs异常表达抑制三阴性乳腺癌进展的研究

发布时间：2018-11-16 10:11

【摘要】：背景:三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)作为乳腺癌的一个亚型,具有恶性程度高、治疗手段少、预后较差等特点。因而,解析TNBC恶性进展的分子机理,寻找有效的治疗靶点对其进行早期干预尤为重要。微小RNA(micro RNA)是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子,在基因的转录后调控中发挥不可忽视的作用。micro RNA通过负性调控靶基因的表达,在诸如个体发育、细胞分化、增殖和凋亡等生理活动以及恶性肿瘤发生发展等病理过程中起调控作用。EZH2是miR-340的一个潜在靶点,可以催化组蛋白H3氨基末端的第27位赖氨酸发生三甲基化(H3K27me3),发挥基因沉默的作用。本课题拟通过对临床病理组织标本及体内、外功能实验进行研究,揭示miR-340通过靶向EZH2可逆转参与三阴性乳腺癌进展的一系列miRNAs异常表达,发挥肿瘤抑制作用,从而为TNBC发生发展的分子机制研究提供更深入的理解,为基于EZH2的TNBC个体化治疗提供理论依据。方法:1.分别应用荧光原位杂交技术和免疫组织化学技术检测乳腺癌组织及其相应癌旁组织中miR-340、EZH2的差异表达情况。比较每组癌组织及其相应癌旁组织间miR-340和EZH2的不同表达情况,对每组表达水平进行评分,分析miR-340与EZH2表达水平的相关性。2.应用RT-PCR及Western-blotting技术分别检测不同乳腺癌细胞系中miR-340、EZH2的表达情况。筛选出差异表达最显著的细胞系:MDA-MB-231及MDA-MB-468细胞系。3.应用生物信息预测软件得到miR-340的潜在靶点EZH2。沉默/过表达TNBC细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468中miR-340的表达水平后,应用Western-blotting技术检EZH2表达水平的变化;应用荧光素酶实验,检测沉默/过表达miR-340后荧光素酶活性改变,明确EZH2是miR-340的靶基因。4.对沉默/过表达miR-340 TNBC细胞系,应用MTT、平板克隆方法观察细胞生长能力的变化;应用流式细胞学技术检测细胞周期及凋亡细胞比例的变化;应用Transwell实验观察细胞侵袭和迁移能力的变化;应用免疫荧光技术检测EMT标志物E-cadherin、β-catenin表达水平及亚细胞定位的变化。5.构建裸鼠皮下沉默/过表达miR-340的移植瘤模型。检测miR-340表达水平改变对乳腺癌发生发展的影响。应用免疫组织化学技术检测miR-340、EZH2、Ki-67、MMP9在沉默/过表达miR-340的裸鼠移植瘤内的表达水平,并对比两组的变化。6.应用免疫组化技术及Western-blot技术检测过表达miR-340后EZH2下游miR-21、miR-200a/b通路上DNMT1、H3K27me3、p-STAT3表达水平的变化;应用RT-PCR及免疫荧光技术检测EZH2下游miR-21、miR-200a/b表达水平的变化。结果:1.通过对62例乳腺癌患者的癌组织及配对癌旁组织miR-340的荧光原位杂交技术检测和EZH2的免疫组织化学检测,发现:与癌旁组织相比,miR-340在癌组织中处于低表达状态,EZH2处于过表达状态。对62例癌组织进行miR-340与EZH2表达水平的综合评分,发现二者表达水平负相关。2.对不同乳腺癌细胞系miR-340与EZH2的表达水平进行检测,发现其在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231及MDA-MB-468中的表达水平与其他细胞系相比有显著差异。3.生物信息学软件预测结果显示,miR-340与EZH2 3’非编码区(3’UTR)具有潜在的结合位点。荧光素酶实验证实miR-340-Mim细胞系荧光素酶活性显著降低,miR-340-Inh细胞系细胞系荧光素酶活性显著升高。4.miR-340-Mim组细胞系细胞增殖能力显著降低,细胞周期G0/G1期比例显著升高,细胞侵袭转移能力降低,EMT上皮性标志物E-cadherin表达水平升高、间质性标志物β-catenin表达水平降低;miR-340-Inh组细胞系细胞的增殖能力显著升高,细胞周期G0/G1期比例显著降低;EMT上皮性标志物E-cadherin表达水平降低、间质性标志物β-catenin表达水平升高。5.构建裸鼠移植瘤模型,对皮下移植瘤体积进行测量,发现:miR-340-Mim组移植瘤体积显著小于对照组;miR-340-Inh组移植瘤生长迅速。与对照组相比,miR-340-Mim移植瘤内miR-340表达水平升高,EZH2、Ki-67、MMP9表达水平降低;miR-340-Inh移植瘤内miR-340表达水平降低,EZH2、Ki-67、MMP9表达水平升高。6.miR-340-mim组细胞系DNMT1、H3K27me3、p-STAT3表达水平降低,miR-21表达水平显著降低,miR-200a/b表达水平显著升高。结论:1.临床数据显示,miR-340在乳腺癌组织中表达水平下调,且与EZH2的表达水平呈负相关。2.研究证实,EZH2是miR-340的一个分子靶点。3.miR-340在TNBC中发挥抑癌基因的作用,通过靶向EZH2,抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力并促进凋亡,同时对乳腺癌原位小鼠模型具有肿瘤抑制作用。调控乳腺癌细胞的增殖、克隆、细胞周期、凋亡以及侵袭转移,抑制TNBC的成瘤性。4.miR-340靶向EZH2一方面通过下调P-STAT3、β-catenin表达逆转miR-21的转录激活,另一方面通过下调DNMT1及H3K27me3表达逆转miR-200a/b的表达沉默,从而抑制三阴性乳腺癌的进展。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】