GPR48在创伤后骨性关节炎进程中的表达调控

发布时间：2018-11-17 14:20

【摘要】：目的通过SD大鼠体内和体外实验,探讨创伤后骨性关节炎进程中关节软骨GPR48表达变化及其与炎症免疫反应因子之间的表达联控关系,尝试进一步揭示创伤后骨性关节炎进程中内在分子机制,为创伤后骨性关节炎的研究和治疗提供新思路。方法(A)体外实验:SPF级雌性4周龄SD大鼠21只,应用颈椎脱臼法处死大鼠,医用酒精浸泡30min,严格无菌条件下取软骨组织,眼科剪剪碎组织法进行原代培养和传代培养,用甲苯胺蓝染色法和COL-II免疫细胞化学染色法进行软骨细胞鉴定。取第3代细胞随机分为加完全培养基组(对照组)、LPS(浓度为20mg/m L)干预组和IL-1β(浓度为10ng/m L)干预组;三组分别在0.5h、1h、6h、24h、48h后,提取各时间点细胞蛋白,BCA法进行蛋白含量测定,应用Western Blot法检测GPR48、TLR4蛋白的表达,Image J半定量分析蛋白表达。(B)体内实验:SPF级雌性4周龄SD大鼠48只,随机分为对照组和实验组,对照组12只,实验组36只。实验组大鼠行双侧前交叉韧带(ACL)横断、内侧半月板切除诱导PTOA,大鼠对照组膝关节打开关节囊后即逐层缝合(行假手术),两组动物按2w、4w、6w末分别处死并取膝关节标本,4%多聚甲醛固定2周,EDTA脱钙2个月,石蜡包埋切片后,进行一般染色(HE)和特殊染色(Masson、VG)观察,免疫组织化学染色法检测关节软骨GPR48、COL-II和TLR4蛋白的表达;光学显微镜下观察并应用IRS评分标准进行评分。应用SPSS17.0统计学软件,采用单因素方差分析检验方法和Pearson相关性分析对数据进行统计学处理,P0.05表示差异有统计学意义。结果(A)体外实验:1甲苯胺蓝染色:正常软骨细胞分泌特征性的酸性糖胺多糖能被甲苯胺蓝染成紫红色,软骨细胞甲苯胺蓝染色后呈异染性。2 COL-II免疫细胞化学染色法:COL-II是软骨细胞特异性的分泌物,因此采用COL-II免疫细胞化学染色证明软骨细胞COL-II呈阳性表达,胞浆内出现棕黄色颗粒。3 Western Blot法检测GPR48和TLR4因子的表达:随干预时间延长,实验组(LPS和IL-1β)中GPR48表达逐渐降低(P0.05),对照组中GPR48表达在不同时间点间差异无统计学意义(P0.05);TLR4在实验组(LPS和IL-1β组)中随干预时间延长表达逐渐升高(P0.05),对照组中TLR4表达在不同干预时间点间差异无统计学意义(P0.05)。IL-1β干预组不同时间点间GPR48与TLR4表达量之间呈负相关(r=-0.991,P0.05);LPS干预组不同时间点间GPR48与TLR4表达量之间呈负相关(r=-0.997,P0.05)。(B)体内实验:成功制备出SD大鼠创伤后骨性关节炎动物模型。1关节软骨HE染色:对照组膝关节软骨表面光滑,软骨陷窝内软骨细胞排列整齐、规则,软骨下骨小梁粗大完整。实验组2w膝关节面相对较好,可见软骨陷窝内软骨细胞排列较整齐,可见细胞簇聚,软骨下骨小梁排列较好,骨小梁厚度增加;实验组4w可见软骨表层细胞丢失,有细胞克隆出现,细胞形态比较正常,排列较紊乱,软骨下骨小梁增多,小梁间间隙变小。实验组6w可见软骨细胞丢失严重,细胞形态异常,且细胞排列紊乱,潮线前移,软骨下骨小梁增多,小梁间间隙更小,且排列紊乱。2关节软骨Masson三色染色:结果可见软骨基质胶原纤维染成蓝色,红细胞及肌纤维呈红色,细胞核呈蓝黑色。实验组可见软骨基质随时间延长而减少,基质染色变浅,红染区减少;对照组无明显变化,且实验组与对照组单位面积内胶原含量2w、4w、6w相比显著降低,差异有统计学意义(P0.05)。3关节软骨VG染色:结果可见胶原纤维染红色。实验组可见软骨基质随时间延长而减少,基质染色变浅,红染区减少。对照组无明显变化。且实验组与对照组单位面积内胶原含量2w、4w、6w相比差异有统计学意义(P0.05)。4免疫组织化学染色检测关节软骨中GPR48与COL-II、TLR4:GPR48与COL-II蛋白的阳性染色呈棕黄色颗粒,均可在软骨细胞表达;实验组各时间点GPR48与COL-II蛋白的表达都低于对照组(P0.05)。TLR4蛋白的阳性染色呈棕黄色颗粒,位于细胞膜和细胞浆,主要表达于软骨细胞,成骨细胞和骨细胞也可见少量表达。实验组各个时间点TLR4蛋白的表达均高于对照组(P0.05),实验组不同时间点GPR48与TLR4蛋白的表达呈负相关(r=-0.925,P0.05)。结论1本实验成功复制了SD大鼠创伤后骨性关节炎模型,并在一定程度上反映出了骨性关节炎的病理变化,为后期研究建立了良好的平台。2体外实验表明,关节软骨细胞在炎性因子IL-1β、LPS分别刺激下,GPR48表达下调,TLR4上调,两者之间表达量呈负相关关系,表明炎性环境下,GPR48负性调控软骨细胞的免疫炎症反应。3体内实验表明,随创伤后骨性关节炎病程发展,关节软骨GPR48表达逐渐下降,TLR4表达逐渐升高,说明GPR48在调控骨性关节炎进程中发挥着重要作用。4在创伤后骨性关节炎的发展进程中,GPR48与炎症反应因子TLR4表达呈负相关,说明GPR48及其介导的炎症反应共同参与骨性关节炎调控,从而为理解骨性关节炎症的分子机制和建立新的治疗靶点提供了一个崭新思路。
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【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R684.3

【共引文献】