【摘要】：背景肝脏移植是目前治疗终末期肝脏疾病最有效的治疗选择。但移植术后急性排斥反应发生造成的移植物失功仍未得到理想的解决。受困于供体肝来源紧缺的国际大环境,更使得如何诱导移植术后移植肝特异性免疫耐受一直是移植领域的研究热点及重点。我们的团队前期研究发现,Kupffer细胞(KCs)作为体内具有高效抗原呈递功能的巨噬细胞群,在术后诱导移植肝脏免疫耐受中起着双重效应,但其确切机制目前尚不清楚。可能与诱导Th亚群细胞间动态平衡以及自身极化有关。新近发现肌醇酶1-X盒连接蛋白1(Inositol Requiring 1-X Box Binding Protein1,IRE1-XBP1)通路不仅参与了非折叠蛋白反应(Unfold Protein Response, UPR),还对抗原呈递细胞(Antigen Presenting Cells, APCs)的功能具有调节作用,但并未涉及肝移植领域。因此探索KCs中IRE1-XBP1通路活性在移植肝免疫反应中的作用与机制,可能为临床实践提供新的靶点以及理论依据。第一部分IRE1-XBP1对Kupffer细胞功能的调控及对初始T淋巴细胞功能和分化的影响目的分离、培养LEWIS大鼠肝脏KCs,通过抑制或上调KCs中IRE1-XBP1活性,观察这一通路对KCs功能的调控及其对初始T淋巴细胞功能及分化的作用机制。方法①采取Ⅳ型胶原酶消化肝脏联合非连续梯度离心法分离Lewis大鼠KCs；②免疫组化、激光共聚焦分别检测KCs表面CD68和CD163的表达来鉴定KCs；③吞墨以及吞荧光乳胶颗粒实验来判断KCs的吞噬能力；台盼蓝染色鉴定KCs的活性。鉴定后的KCs随机分为四组：XBP1抑制组(XBP1-shRNA group);错义序列沉默对照组(Scrambled-shRNA group, Ctrl-shRNA); XBP1过表达组(AdV-XBP1 group);错义序列过表达对照组(AdV-Scrambled group, Ctrl-AdV);④荧光显微镜下以及激光共聚焦检测法评估质粒转染效率；⑤RT-PCR以及Western Blot检测各组KCs中XBPKIL-6. IFN-γ、TNF-α、IL-17、JAK1、JAK2、STAT1以及STAT3的基因及蛋白表达水平；⑥流式细胞术(FCM)以及激光共聚焦检测各组KCs表型的变化情况；⑦ELISA检测KCs自分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17的水平；⑧分离大鼠脾脏淋巴细胞,尼龙毛柱过滤纯化T细胞,FCM检测纯度,与上述各组KCs共培养,MTT法及Brdu渗入法检测T细胞增殖情况；⑨Annexin V/PI法FCM观察T淋巴细胞凋亡情况；⑩ELISA测定上清液中IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17及IL-10含量。结果①KCs细胞表面CD68和CD163呈强阳性及强荧光强度表达,提示我们提取的是大鼠的KCs。吞噬实验以及台盼蓝染色提示分离培养的KCs具有良好的吞噬能力及活性；②转染XBP1的沉默质粒以及过表达质粒后,6h开始零星出现荧光表达,48小时前后达到高峰,2w后开始逐渐下降；RT-PCR以及WB结果显示,XBP1沉默组中XBP1的表达量较对照组显著降低,而在XBP1过表达组则明显上调；③FCM以及激光共聚焦术发现,XBP1沉默组中MHC-Ⅱ、IICD86、CD40的表达明显低于对照组,而CD204和CD206的表达则显著高于对照组；而在XBP1过表达组,则呈相反趋势；④WB检测发现XBP1沉默组中JAK1JAK2、STAT1和STAT3的蛋白表达及其磷酸化水平均受到抑制,而在XBP1过表达组则上述蛋白的表达及磷酸化水平得到显著增强；⑤FCM检测T细胞纯度为78.73±4.35%,其中CD4+为58.84±10.47%,CD4+/CD8+T细胞比例为2.95。和各组KCs共培养3d后,发现抑制KCs中IRE1-XBP1活性后T细胞增殖受到明显抑制,凋亡增加,促炎细胞因子分泌减少,抗炎细胞因子分泌增加(P0.05),而上调KCs中IRE1-XBP1活性后T细胞增殖则明显增强,凋亡明显减少,促炎细胞因子(FN-γ、TNF-α)分泌增加,抗炎细胞因子(IL-10)分泌减少(P0.05)。结论①KCs中IRE1-XBP1通路活性变化可以转化KCs的极性状态,并通过调节JAK-STAT家族成员表达,调控KCs自分泌细胞因子的组成成分；②KCs中IRE1-XBP1通路活性变化可以影响共培养初始T淋巴细胞的增殖分化、凋亡以及相关细胞因子的分泌。第二部分大鼠原位肝移植急性排斥模型建立和携XBP1-shRNA质粒的脂质包裹液态氟碳纳米粒靶向转染Kupffer细胞的效果评估目的建立LEWIS-BN大鼠原位肝移植急性排斥反应模型,用携带XBP1-shRNA的脂质包裹氟碳纳米粒(perfluorocarbonnanoparticles,PFCN)与XBP1-shRNA'漫病毒分别转染上述急性排斥反应模型,评价两种不同转染载体对KCs靶向性干扰的高低。方法采用改良Kamada"双套管”法建立LEWIS-BN大鼠原位肝移植急性排斥反应模型；采用两步乳化法制作脂质包裹的PFCN乳液,通过正负电荷连接XBP1-shRNA质粒。(1)XBP1-sRNA-PFCNP组：经门静脉注射XBP 1-shRNA-PFCNP(1 ml/1000g),1×109Tu/mL,再推注2mL生理盐水；(2)XBP 1-shRNA-Lentivirus组：经门静脉注射XBP 1-shRNA-Lentivirus 2mL, 1×109Tu/mL;(3)对照组：经门静脉推注生理盐水2mL。观察转染后3天及7天KCs、肝细胞、脾脏及小肠中XBP1的表达改变。结果①PFH以1：8的比例、声震时间80s得到性质稳定的平均粒径为283.78±23.16的PFCN;成功建立稳定的LEWIS-BN大鼠原位肝移植模型；②RT-PCR与WB结果提示：术后第3d, PFCN组及慢病毒组均能有效抑制KCs中XBP1的表达,抑制效率未见统计学差异；同时两种方式对肝细胞及小肠内XBP1也有抑制作用,但慢病毒组抑制程度明显高于PFCN组；③术后7d,慢病毒组对KCs中XBP1的抑制程度明显弱于PFCN组,而对肝细胞内XBP1的抑制作用则明显强于PFCN组;PFCN组对脾和小肠的影响与对照组无统计学差异,而慢病毒组则持续抑制,但抑制率较3d时减弱。结论LEWIS-BN是一种稳定的大鼠肝移植急性排斥反应模型；采用改良”双套管”法能稳定高效的构建这一模型；携带XBP1-shRNA的PFCN作为转染载体,较慢病毒经由门静脉高压注射转染,具有更高的KCs靶向性以及抑制效率。第三部分阻断Kupffer细胞中IRE1-XBP1通路活性诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究目的观察阻断移植肝KCs中IRE1-XBP1通路活性对大鼠肝移植急性排斥反应模型的作用及机制。方法①采取改良"Kamada"双套管法建立LEWIS-BN大鼠肝移植急性排斥反应模型；②受体随机分为三组：生理盐水组(NS),错义序列沉默对照组(Scrambled-shRNA group, Ctrl-shRNA)和沉默组(XBP1-shRNA),剂量参考第二部分。③观察术后7天各组受体生存时间与肝功能变化；移植肝病理改变；④TUNEL检测移植区细胞凋亡情况；⑤ Real-time PCR检测肝组织中T-bet、RORγt、 IFN-γ、IL-17及IL-10mRNA表达水平；Western Blot检测移植肝中CD40、CD86、CD204、CD206、IFN-γ、IL17及几-10蛋白表达水平；⑥ELISA检测外周血中IFN-y. IL-17和IL-10的表达水平。结果①术后第7天,沉默组受体存活时间以及肝功能较其余两组得到明显的改善(P0.05); RAI评分属轻度排斥反应,其余两组呈重度排斥反应。TUNEL显示沉默组汇管区淋巴细胞凋亡程度远远高于对照组以及生理盐水组。②沉默组中T-bet、RORyt、IFN-γ、IL-17的mRNA相对表达量均明显低于对照组以及生理盐水组(P0.05)。而IL-10的含量则高于其余两组(P0.05)。③沉默组中CD40、CD86、 IFN-y、IL-17的蛋白表达明显减弱,而CD204、CD206和IL-10的蛋白水平则较其余两组明显上调(P0.05)。④ ELISA结果提示随着移植后时间的推移,沉默组外周血清中IFN-γ、IL-17的表达量与对照组以及生理盐水组比较,逐渐降低(P0.05)；而IL-10的表达则逐渐增加(P0.05)。结论体内阻断KCs中IRE1-XBP1通路能显著减轻AcR对肝脏组织的破坏程度并诱导免疫耐受形成；其机制可能与诱导活化M1样KCs向M2样KCs转化,并使KCs分泌细胞因子性质从促进炎症反应型向移植免疫反应类型变化,进而诱导Th1/Th17向Th2/Treg免疫偏倚密切相关相关；
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3
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