雷帕霉素对创面愈合的影响及其机制研究

发布时间：2019-01-11 21:09

【摘要】：研究背景难愈性创面常见于大面积烧伤、糖尿病足溃疡、缺血性溃疡、下肢静脉曲张溃疡、手术后感染、压疮等。由于患者营养状况不良、细菌感染、难以控制的高血糖、创面局部血液循环障碍、全身或局部炎症反应重等多种因素,往往导致创面迁延不愈,严重影响患者的生活质量和生命健康。创面愈合过程中参与组织修复的细胞发生大量凋亡,细胞功能损伤导致细胞因子分泌严重不足,细胞间交互协同活动紊乱,皮肤免疫微环境发生失衡,由此导致创面难以愈合。因此,深入研究创面修复过程中的细胞功能和细胞间相互作用及分子机制,对于研发对新的创面免疫治疗方法非常重要。创面愈合的细胞生物学基础依赖于表皮细胞快速增殖、迁移和分化,以及需多种多样的细胞因子维持细胞存活和增殖,来促进创面快速修复。表皮细胞主要由90%的角质细胞(keratinocytes,KCs)和少量在结构上与其紧密相连的树突状表皮γδT细胞(dendritic epidermalγδT cells,DETCs)构成。它们相互依存,共同调控正常的皮肤屏障功能,共同促进创伤的修复过程,维护皮肤表皮层免疫微环境的平衡和稳定。雷帕霉素(rapamycin,雷帕霉素)最初被发现是一种来源于亲水链霉素菌属的抗真菌药物,是一种特异性的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)抑制剂。mTOR通路被认为可“管控一切细胞活动”,与细胞的生长、增殖、分化和新陈代谢密切相关。雷帕霉素因调控m TOR通路发挥其强大的免疫抑制功能,抗恶性肿瘤细胞增殖和抗肿瘤血管生成的功能,被广泛用于预防器官移植后的急性免疫排斥反应和部分恶性肿瘤的治疗。近些年来雷帕霉素和mTOR通路对于创面愈合的影响也有所报道,但得到的结论并不一致。有研究报道雷帕霉素延迟创面愈合,而另有研究则认为雷帕霉素促进烧伤创面的早期愈合。本课题研究中,我们设定了不同剂量的雷帕霉素,研究其对表皮细胞数量及功能的影响,进一步观察其对创面愈合的影响作用。通过检测表皮细胞中角质细胞分泌的IL-15和DETCs分泌的IGF-1的变化和相互关系,深入探索表皮中角质细胞与DETCs交互协同的功能。通过体内外的实验研究我们发现,雷帕霉素对表皮细胞的数量、功能的作用以及对创面的愈合的影响具有剂量依赖性及时间依赖性。小剂量的雷帕霉素通过调控Akt/m TORC2通路促进表皮细胞的功能和创面愈合的进程,而大剂量的雷帕霉素显著抑制mTORC1通路,延长作用时间后亦可抑制表皮中的mTORC2通路,因此明显延缓创面愈合过程。本研究为未来临床创面及难愈性创面的免疫学治疗提供了新的思路和新的机会。目的本研究探索雷帕霉素对表皮细胞和树突状表皮γδT细胞数量、功能的影响及其作用模式,以及由此对创面愈合产生的影响及其可能的机制。期望该研究能为未来临床治疗创面提供新的思路。方法1.不同剂量的雷帕霉素对表皮细胞生存的影响体外预实验通过初步的细胞计数摸索出小剂量和大剂量雷帕霉素,CCK-8实验观察不同剂量雷帕霉素对表皮细胞数量的影响;2.不同剂量的雷帕霉素对DETCs数量的影响通过流式细胞技术检测不同剂量雷帕霉素对表皮细胞中和创面愈合过程创周表皮中DETCs数量的影响;3.不同剂量的雷帕霉素对创面愈合的影响在体预实验摸索出可影响创面愈合的小剂量和大剂量雷帕霉素。通过制作小鼠全层皮肤缺损的创面模型,绘制创面愈合曲线,HE染色测量新生上皮并计算,观察不同剂量的雷帕霉素对创面愈合第0天到第7天的影响;4.不同剂量的雷帕霉素对IL-15和IGF-1表达的影响通过Real-time PCR、WB、细胞内流式细胞技术及免疫组织化学法的方法检测表皮细胞及创面愈合过程中创周表皮中IL-15和IGF-1的表达变化,进一步了解不同剂量雷帕霉素对表皮细胞免疫微环境的影响;5.不同剂量的雷帕霉素对m TORC1通路的影响通过WB方法检测表皮细胞及创面愈合过程中m TORC1相关骨架蛋白Raptor,下游分子p70S6K和4E-BP1的表达变化,观察不同剂量雷帕霉素在不同作用时间点对mTORC1信号通路的影响变化;6.不同剂量的雷帕霉素对m TORC2通路的影响通过WB方法检测表皮细胞及创面愈合过程中m TORC2雷帕霉素不敏感伴随复合物Rictor,SIN1及下游分子Akt的表达变化,观察不同剂量雷帕霉素在不同作用时间点对mTORC2信号通路的影响变化;7.IL-15-IGF-1的相互作用通过Real-time PCR、WB、胞内流式细胞技术及免疫组织化学法的方法检测IL-15与IGF-1相互关系,以验证角质细胞和DETCs在表皮层发挥交互协同的功能。结果1.雷帕霉素对表皮细胞的生物学效应具有选择性和剂量依赖性1.1设定雷帕霉素为四种不同的工作浓度(5 ng/ml,10 ng/ml,15 ng/ml,20 ng/ml)作用于表皮细胞,进行细胞计数预实验。24小时后发现5 ng/ml雷帕霉素剂量组中表皮细胞数量较DMSO对照组平均增加1548个,余三种剂量组间细胞数量相似,最终决定5 ng/ml雷帕霉素作为小剂量,20 ng/ml雷帕霉素作为大剂量;1.2不同剂量雷帕霉素作用于表皮细胞12和24小时后,CCK-8实验结果显示:小剂量雷帕霉素组中细胞平均吸光度分别为0.782和0.77,均高于对照组;大剂量雷帕霉素刺激表皮细胞24小时后测得平均吸光度均低于对照组。说明小剂量雷帕霉素维持表皮细胞的存活,大剂量雷帕霉素作用后表皮细胞数量减少;1.3流式细胞技术实验结果发现,不同剂量雷帕霉素刺激表皮细胞24小时后,小剂量雷帕霉素并不影响表皮细胞中DETCs的数量,大剂量雷帕霉素使得DETCs数量减少。2.雷帕霉素对创面愈合的作用具有剂量双向效应,即小剂量促进愈合,大剂量延迟愈合2.1设定雷帕霉素为四种不同的剂量:4mg/kg、0.4 mg/kg、0.04 mg/kg和0.004 mg/kg。肉眼观察创面愈合发现4mg/kg雷帕霉素组中小鼠创面愈合明显延缓,0.04mg/kg组中小鼠创面愈合较正常对照组加快。最终决定在体实验中0.04 mg/kg雷帕霉素作为小剂量,4mg/kg作为大剂量;2.2设计小鼠全层皮肤缺损的创面愈合实验,制作创面愈合曲线发现:0.04mg/kg小剂量雷帕霉素促进创面愈合的过程,4mg/kg大剂量雷帕霉素导致创面愈合明显延缓;2.3制作创面后第3天、第6天小鼠创面病理组织经石蜡包埋和HE染色后测量新生上皮长度。小剂量雷帕霉素组中新生上皮长度分别为901μm和1449μm,长于正常对照组的619μm和1058μm;大剂量雷帕霉素组中新生上皮长度分别为340μm和672μm,明显少于正常对照组。说明小剂量雷帕霉素促进创面新生上皮形成,大剂量雷帕霉素使得创面再上皮化障碍。3.雷帕霉素对表皮中IL-15和IGF-1的表达呈剂量双向效应,即小剂量促进IL-15和IGF-1的表达,大剂量抑制IL-15和IGF-1的表达3.1通过Real-time PCR、WB、胞内流式细胞技术的方法检测表皮细胞中IL-15和IGF-1的表达变化,发现小剂量雷帕霉素刺激10分钟即促进IL-15和IGF-1的表达上调,持续至24小时;大剂量雷帕霉素则显著抑制IL-15和IGF-1的表达;3.2通过WB、免疫组织化学染色法发现,创面愈合过程中表皮层中IL-15和IGF-1在创面愈合早期即进入表达上调的高峰,一直持续到创面愈合的再上皮化期;大剂量雷帕霉素则明显抑制创面愈合全过程中IL-15和IGF-1的表达。4.在表皮细胞和创周表皮中,雷帕霉素对m TOR通路的影响具有剂量依赖性和时间依赖性4.1在表皮细胞和创周表皮中,小剂量雷帕霉素对m TORC1通路的表达无明显影响;在表皮细胞中,小剂量雷帕霉素可快速激活p-SIN1(Thr86),促使p-Akt(Ser473)激活,从而全面激活Akt/m TORC2通路;在创面愈合过程中,在小剂量雷帕霉素的作用下,创周表皮中p-Akt(Ser473)也被激活;4.2在表皮细胞和创周表皮中,大剂量雷帕霉素显著抑制下游分子p-p70S6K(Thr389)和p-4E-BP1(Thr37/46)的表达,故mTORC1通路被抑制。延长作用时间后,p-Akt(Ser473)表达显著下调,抑制了mTORC2通路;5.角质细胞分泌的IL-15可促进DETCs分泌IGF-1增加,而DETCs分泌的IGF-1可促进角质细胞分泌IL-15增加。5.1通过胞内流式细胞染色技术,发现rm IL-15可促进表皮细胞中IGF-1含量增加,rm IL-15和小剂量雷帕霉素共同作用后进一步的促进IGF-1分泌增多;通过Real-time PCR、WB方法,发现rm IGF-1可促进角质细胞分泌IL-15升高;5.2在糖尿病小鼠难愈性创面模型中,创面愈合过程中创周注射rm IL-15可促进创面愈合加速;免疫组织化学法检测发现糖尿病小鼠创周给予rm IL-15或rm IGF-1,可对应的促进创面边缘表皮中IGF-1或IL-15升高;这些结果提示我们,在表皮细胞中角质细胞分泌的IL-15和DETCs分泌的IGF-1相互影响。结论总结本课题的研究结果,可以得到以下结论:1.雷帕霉素对表皮细胞的生物学效应具有选择性和剂量依赖性;2.雷帕霉素对创面愈合的作用具有剂量双向效应,即小剂量促进愈合,大剂量延迟愈合;3.雷帕霉素对表皮中IL-15和IGF-1表达呈剂量双向效应,即小剂量促进,大剂量抑制;4.在表皮细胞和创周表皮中,雷帕霉素对m TOR通路的影响具有剂量依赖性和时间依赖性;5.表皮中,角质细胞分泌的IL-15和DETCs分泌的IGF-1相互影响、相互作用。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R64

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