大鼠骨髓间充质干细胞分泌Exosome在心脏移植存活中的作用

发布时间：2019-03-13 09:25

【摘要】：目的:从大鼠骨髓中分离出具有多向分化潜能的骨髓间充质干细胞方法:大鼠全骨髓培养,贴壁筛选法纯化传代。镜下观察细胞形态学特征,流式细胞术鉴定细胞表面抗原表达。成骨,成脂,成软骨分化实验检测细胞分化功能。结果:通过贴壁筛选的方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,至第3代时贴壁细胞接近80%-90%融合,镜下观察可见细胞形态呈比较均一的成纤维状,连续传代,细胞形态无明显变化。流式结果显示:超过90%大鼠骨髓间充质干细胞性表达CD29(细胞整合素分子)CD90;超过80%大鼠骨髓间充质干细胞性表达CD44(粘附分子,介导细胞对透明质酸和骨桥蛋白的粘附)、CD73。不表达CD34(祖细胞表面的分化抗原)CD45和造血祖细胞表面标志CD11b,符合大鼠骨髓间充质干细胞特征。成骨、成脂、成软骨诱导分化结果显示:成脂诱导72小时后,镜下观察可见细胞胞质染色加深,约5天后细胞内有小脂滴出现,诱导过程脂滴数量增加并相互融合,细胞由长梭形变为圆形或多边形。诱导15天后,油红O染色显示有大量脂质沉淀。成骨诱导约3天细胞有所增值,细胞呈多角形;6天,胞质内充满颗粒,细胞呈集落样聚集,细胞间可见少量钙质沉积;10天后,细胞结节中心的细胞逐渐融合失去细胞结构,钙结节形成明显;16天,细胞表面出现大量钙质沉积,经茜素红染色呈红色结节。成软骨诱导24小时后,细胞成一团颗粒状漂浮在诱导液中,诱导过程细胞团表面逐渐变得光滑,诱导21天后,固定染色表现为软骨特征。符合骨髓间充质干细胞定向分化特征。结论:大鼠全骨髓培养,贴壁筛选法纯化传代可成功分离得到大鼠骨髓间质干细胞。目的:采用改良型Ono术式建立大鼠腹腔异位心脏移植模型方法:wistar大鼠心脏作为供体,SD大鼠作为受体,采用改良型Ono术式建立大鼠腹腔异位心脏移植模型。后采用多普勒心脏彩超、HE染色评估模型建立效果。结果:心脏移植建模7天、15天后大鼠移植心脏左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVEDs)、左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短指数(FS)显示成功建立大鼠腹腔异位心脏移植模型。移植心脏形大体观可见:移植7天后移植心脏颜色与刚移植心脏颜色相同为红色,腹腔内可见积液。15天后心脏颜色明显变得暗淡,周围肠管肿胀。30天后移植心脏颜色变暗,与周围肠管发生粘连。HE染色显示:移植7天心肌细胞排列稍紊乱血管周围可见少量炎症细胞浸润。移植15天后心肌细胞排列紊乱,血窦内可见炎症细胞浸润。30天后心肌心肌细胞排列非常紊乱,血管周围有大量炎症细胞浸润。结论:采用改良型Ono术式成功建立大鼠腹腔异位心脏移植模型,并降低死亡率。目的:体外明确大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分泌的Exsome发挥免疫抑制效果的靶细胞,体内进一步验证体外结果。明确大鼠骨髓间充质干细胞分泌的Exsome在移植心脏存活中的作用。方法:1、体外采用BMSCs分泌的exosome与DC细胞共培养、BMSCs分泌的exosome与T细胞共培养、BMSCs分泌的exosome与DC细胞+ T细胞共培养。DC细胞单独培养、T细胞单独培养、C细胞与T细胞共同培养作为阴性对照。将BMSCs细胞分泌的exosome调整终浓度为800mg/ml,使每组加入浓度—致,DC细胞、T细胞细胞计数后按照1:1的比例混合培养48H、72H、96H后采用流式细胞术检测DC细胞和T细胞表面分子表达量。2、大鼠腹腔异位移植心脏模型建立后经尾静脉注射BMSCs分泌的exosome,给予吗替麦考喂养作为药物对照,不做任何处理组作为阴性对照,正常未移植组作为阴性对照,在相同条件下喂养2、4、7天后取其脾脏进行流式细胞术检测DC细胞和T细胞表面分子表达量。3、大鼠腹腔异位移植心脏模型建立后经尾静脉注射BMSCs分泌的exosome,给予吗替麦考喂养作为药物对照,不做任何处理组作为阴性对照,在相同条件下喂养2、4、7天采用多普勒心脏彩超和小动物活体成像评估移植心脏功能。结果:1、BMSCs分泌的exosome在共培养48H与72H时对DC细胞的作用没有明显的规律,当在共培养达到96H时对DC细胞的作用开始出现规律性的变化。当BMSCs分泌的exosome在与T细胞共培养时,Treg细胞表达量在48H、72H时都为最高,在96H时有所降低但无显著性差异。CD3+CD4表达量在48H、72H时都为最低,在96H时有所升高。CD3+CD8表达量在48H、72H、96H时都最低。2、BMSCs分泌的exosome对DC细胞的作用没有明显的规律,而其Treg细胞表达量在喂养2天后表达量为各组最高、在喂养4天后较吗替麦考组表达有所降低,但无显著性差异,较模型未处理组与正常组上升、在喂养7天后正常组表达有所降低,但无显著性差异,较模型未处理组与较吗替麦考组上升。3、心脏彩超结果显示:大鼠移植模型建立后给予BMSCs分泌的exosome处理后2天移植心脏射血分数、环比收缩较建模未处理组有显著改善,与吗替麦考组无显著性差异,移植模型建立后给予BMSCs分泌的exosome处理后4天移植心脏射血分数、环比收缩较建模未处理组有显著改善,较吗替麦考组心脏功能有所上升,移植模型建立后给予BMSCs分泌的exosome处理后7天移植心脏射血分数、环比收缩较其他各组均有显著改善。小动物活体成像结果显示:大鼠移植模型建立后给予BMSCs分泌的exosome处理后2天、4天、7天移植心脏荧光强度均为各组最强。结论:大鼠骨髓间充质干细胞分泌的exosome发挥免疫抑制作用的靶细胞为T细胞,可促进exosome聚集于移植心脏并改善其功能。
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【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R654.2

【参考文献】