G3BP1介导乳腺癌上皮—间质转化及其作用机制研究

发布时间：2019-04-17 18:53

【摘要】：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤,是女性癌症患者的重要致死原因。乳腺癌的侵袭和转移是导致病人死亡的关键所在。上皮-间质转化(EMT)参与乳腺癌转移和耐药等疾病过程,推动原位癌向侵袭性乳腺癌发展。G3BP1作为Ras的调节蛋白,能够参与肿瘤发生过程中细胞增殖、运动、侵袭和凋亡等多项生命活动。我们的前期研究发现,下敲G3BP1能抑制人非小细胞肺癌H1299细胞的迁移和侵袭,提示G3BP1可能与EMT相关。本课题就G3BP1与EMT的相关性展开研究,并进一步研究其分子作用机制。此外,我们还发现G3BP1能够调控乳腺癌细胞的增殖,β-Catenin信号通路参与调控细胞增殖活动,因此我们还初步探讨了G3BP1对β-Catenin信号通路的调控作用及作用机制。目的：1、阐明G3BP1介导乳腺癌细胞EMT过程。2、阐明G3BP1对Smad信号通路的调控作用及作用机制。3、验证G3BP1在乳腺癌转移中的作用,探讨其作为新的乳腺癌转移分子标志物的可能性。4、初步探讨G3BP1对P-Catenin信号通路的调控作用及作用机制。方法：1、检测G3BP1是否参与调控乳腺癌细胞EMT过程。首先构建了可稳定表达人源G3BP1的质粒,并稳定转染MDCK细胞,构建了G3BP1稳定高表达的MDCK细胞系。在该模式细胞中,分别观察了细胞形态的变化,运用Western blot方法检测了EMT标志蛋白表达水平的变化,运用免疫荧光方法检测细胞骨架蛋白的变化情况,运用Transwell迁移和Matrigel transwell侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化。接下来,我们在人乳腺癌细胞MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中,分别采用瞬时／稳定高表达和下敲G3BP1的方法,运用相同方法检测了G3BP1对EMT的调控作用。2、检测调控EMT过程的Smad信号通路。在MCF-7和MDA-MB-231细胞中,运用Western blot方法检测瞬时／稳定上调或下调G3BP1对Smad磷酸化水平的影响。运用Real-time PCR方法,检测该信号通路相关基因的转录水平。采用CO-IP方法,检测G3BP1与Smads的相互作用。采用干扰RNA技术,寻找发挥调控EMT作用的转录因子和Smad蛋白。3、检测G3BP1在乳腺癌转移模型中的作用。构建4T1-luc G3BP1稳定下敲细胞系,建立了小鼠体内乳腺癌转移模型。运用活体动物成像技术,检测G3BP1下敲对乳腺癌原位瘤及转移瘤的影响。运用HE染色方法来观察原位瘤和转移瘤的病理变化。并采用Western blot方法检测原位瘤组织中EMT标志蛋白的表达情况。4、检测G3BP1对P-Catenin信号通路的调控作用。运用SRB检测方法,检测上调或下调G3BP1的表达对MCF-7细胞增殖的影响。采用Western blot方法检测了β-Catenin信号通路相关蛋白和靶基因的表达变化。运用双荧光素酶实验和β-Catenin核积累的变化指示该信号通路的活化情况。通过Western blot方法,检测了G3BP1对GSK-3β磷酸化水平的影响以及GSK-3β激酶抑制剂对G3BP1表达水平的影响。采用CO-IP方法检测G3BP1与GSK-3β的相互作用。结果：1、结果显示,G3BP1高表达诱导MDCK细胞发生EMT过程；G3BP1瞬时/稳定高表达诱导MCF-7细胞发生EMT过程；G3BP1瞬时/稳定下敲抑制MDA-MB-231细胞的间质细胞表型。2、对调控EMT的Smad信号通路进行研究,发现在MCF-7细胞中高表达G3BP1能够促进Smad信号通路的活化；在MDA-MB-231细胞中下敲G3BP1能够抑制Smad信号通路的活化；该调控作用不依赖于外源性TGF-β1。CO-IP结果显示,G3BP1与Smads特别是Smad2/4存在相互作用。下敲Slug几乎能逆转G3BP1介导的EMT过程；而下敲Smad3后,G3BP1几乎不能发挥介导EMT过程的作用。3、G3BP1稳定下敲能抑制4T1细胞的间质细胞特性。稳定下敲G3BP1,能够抑制4T1细胞在小鼠体内形成原位瘤及转移瘤。原位瘤中的细胞能够保持G3BP1稳定下敲的细胞特性。4、高表达G3BP1有促进MCF-7细胞增殖的趋势,下调G3BP1的表达显著抑制其增殖。高表达G3BP1能促进β-Catenin信号通路活化,下敲则能抑制其活性。G3BP1能调控GSK-3β激酶的磷酸化,并与GSK-3β存在相互作用。GSK-3β特异性抑制剂SB216763能够时间及浓度依赖性地下调G3BP1的表达水平。结论：1、在体外实验中,G3BP1能够调控乳腺癌细胞的迁移和侵袭；在小鼠体内乳腺癌转移模型中,G3BP1能调控乳腺癌细胞的转移。这些发现揭示了G3BP1在乳腺癌转移过程中的重要作用,提示G3BP1可作为一种潜在的抗乳腺癌转移药物的靶标。进一步的研究发现,G3BP1通过EMT过程实现对乳腺癌细胞转移的调控,G3BP1能通过Smads活化以及上调Slug转录因子的表达调控乳腺癌细胞EMT过程。本研究从分子和细胞水平揭示G3BP1调控EMT过程的作用机制。G3BP1能募集Smad2/4复合物,提示G3BP1有可能作为一种新发现的Smad辅助因子。2、G3BP1有可能通过调控GSK-3β激酶活性调控β-Catenin信号通路,通过该信号通路进一步调控细胞增殖。该发现为G3BP1在乳腺癌增殖方面作用提供依据。GSK-3β特异性抑制剂SB216763促进G3BP1的降解,提示其可能是一种新的G3BP1调控剂。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【参考文献】