马凡综合征的分子诊断与外科治疗研究

发布时间：2019-04-21 20:21

【摘要】：第一部分利用二代测序技术检测马凡综合征患者致病基因突变目的：马凡综合征是一种常染色体显性遗传病,由于结缔组织病变引起骨骼、眼部和心血管系统受累,易导致主动脉扩张和夹层,致病基因为FBNl。TGFBR2基因发生致病突变也可以出现类似症状。我们希望通过二代测序技术检测马凡综合征患者基因型,验证临床诊断,同时检测二代测序技术对FBN1基因和TGFBR2基因覆盖度、准确率。方法：选择两名根据Ghent标准确立临床诊断的马凡综合征患者,他们来自不同家系,经同意后采集外周血样本。通过Ion AmpliSeq Designer订制功能设计专门适合马凡综合征患者基因检测的多重PCR引物Panel;提取患者基因组DNA；通过PCR反应用Panel中设计好的引物对目标片段文库进行扩增并加装接头；用Ion OneTouch2油包水PCR仪对文库进行构建；使用Ion PGM系统对模版DNA测序；测序结果利用Ion Torrent平台专属软件Torrent Suite v4.2.1进行处理并用多种在线软件进行生物信息学分析。结果：通过Ion PGM二代测序仪对来自于两个不同家族的马凡综合征患者基因组DNA的FBN1基因和TGFBR2基因进行选择性测序,平均输出589714读长,每个样本命中率平均为89.87%。目标区域平均测序深度是794层。发现了19个已知或者新的突变。其中第一个患者有16个突变,第二个患者有15个突变。19个突变中,12个为终止突变,2个为同义突变,5个为非同义突变,包括3个错义突变,1个无义突变以及1个移码突变。结论：通过Ion torrent PGM二代测序平台,设计专门Panel,对马凡综合征患者FBNl、TGFBR2进行基因检测,方法可行并且具有高效,准确的特点。第二部分用Sanger测序法对二代测序补充及结果验证目的：应用Sanger测序对二代测序得到的FBN1和TGFBR2检测结果进行补充测序,同时对于二代测序发现的所有突变,应用Sanger测序技术提供验证。通过比较Sanger测序与之前Ion Torrent测序结果的吻合性来评价二代测序用于检测FBNl和GFBR2这两个多外显子基因的可靠程度。同时利用一代测序对先证者家系成员和健康人群基因组DNA目标片段测序并进行生物信息学分析,判断所发现基因突变的致病性。方法：在征得书面同意后,对所有的先证者和患者家庭成员进行病史采集。采用统-问卷形式记录患者信息,绘制家系图。对照Ghent诊断标准为患者系统症状评分。采集患者及血亲的血样7m1进行基因检测。同时对本院进行健康体检的正常人群400例基因组DNA进行比对测序。测序完成后用Chromas3.0软件将测序数据转化成可读格式,再利用Dnaman v6.0.40软件完成序列比对分析。根据我们采集的临床资料结合测序结果对基因突变导致的生物学效应进行分析解释。结果：对FBN1和TGFBR2基因的补充测序没有发现新的突变位点。通过对马凡综合征患者基因组DNA的重测序,我们确认了之前二代测序的结果。其中无义突变c.1585CT,p.Arg529X,SNP位点编号rs137854476以及新发现的一个移码突变c.6355_6356insTG, p.G2120fsX2160是致病突变,患者家庭成员中被检测该突变的人有相应表型特征,属于马凡综合征患者。新发现的另一个错义突变是良性SNP, c.913AG,p.Thr305Ala在患者及表型正常家属和健康人群中检测到。结论：我们通过Sanger测序法验证了二代测序技术对于马凡综合征致病基因FBN1和TGFBR2检测的有效性。通过FBN1致病基因突变的发现对马凡综合征患者进行了确诊。第三部分中低温停循环在急性A型夹层全弓置换手术当中的应用目的：A型主动脉夹层是马凡综合征最严重的并发症,我们采用全弓置换+象鼻支架植入的方式对其进行治疗。并在实践中改进方法,将停循环合并顺行脑灌注进行弓部置换时的低温水平升高到中低温的程度(咽温20.1-28℃)。通过总结临床资料,分析查找手术危险因素,评价这一手术方式对马凡综合征患者治疗的效果。方法：连续收集2010年至2013年在我院心胸外科接受全弓置换手术的99名患者围手术期资料,按照中低温组和深低温组分为两组,进行回顾性比较研究。分类变量的比较使用卡方检验或Fisher's确切概率法。连续性变量使用非配对t检验比较,对影响30大死亡率以及神经功能不良事件(包括一过性和永久性神经功能损伤病例)的因素进行Logistic回归分析。纳入回归模型的变量和校正因子包括：年龄、性别、体重指数、高血压、糖尿病、是否为急诊手术、术前左室EF值、是否患有乙肝、手术时长、体外循环时间、停循环时间、冠心病、术前休克、术前透析、体外循环时间超过40min、低温分组(咽温20。C分界)、术中红细胞消耗量、术中新鲜冰冻血浆消耗量。结果：全组患者采用全弓置换+象鼻支架手术治疗。根部手术操作中Bentall术式占绝大多数33例(84.6%)。一过性神经功能损伤的概率是17.2%。30天死亡人数17人。全体患者平均手术时长508.8±80.0min,平均体外循环时间227.9±37.3min,心肌阻断时间127.6±23.6min,低温停循环时间29.9±6.0min。马凡综合征患者5人,平均年龄30.0±7.4。接受手术的马凡综合征患者全部治愈出院。一人出现一过性神经功能紊乱。多因素分析发现停循环时深低温(咽温14-20℃)是神经功能损伤独立危险因素(P=0.031；OR=0.385；95%CI=0.162-0.919)。随访1-4年,1人因再发B型夹层住院治疗,没有出现死亡病例。结论：应用主动脉全弓置换+象鼻支架植入技术治疗马凡综合征安全有效,术中采用中低温保护策略可以减少患者术后神经功能不良事件的发生率。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R654.3

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