犬同种异体椎间盘移植的动物实验研究

发布时间：2019-05-18 07:50

【摘要】：背景椎间盘退变引起的下腰痛(Low Back Pain LBP)已经成为影响人类正常生活最主要的职业性疾病之一。近年来,许多国家报道每年用于该类疾病的治疗及预防的经费已经对其造成了巨大的经济负担,因此针对椎间盘退变的研究具有十分重要的意义。椎间盘退变有许多病理学表现,如髓核组织水分丢失、纤维环变性破裂,终板损伤等。目前的主要研究认为椎间盘退变的最终途径是营养通道的缺失,而椎间盘内的营养物质几乎都来自于终板血管的弥散作用。目前关于基因、细胞等治疗方式的研究主要着重于修复退变的髓核组织,且主要适用于早、中期退变的患者,并未针对主要影响椎间盘营养弥散功能的终板进行研究。近50年来,同种异体椎间盘移植技术作为一种新的治疗方法,已在部分动物实验和临床治疗中开展,且取得了良好的疗效。然而,对于移植术后椎间盘营养功能的变化情况目前仍不清楚。动态对比增强核磁共振(Dynamic Contrast-enhanced Magnetic Resonance Imaging, DCE-MRI)在增强造影剂的辅助下可以获得组织的灌注及血流情况,目前已在各个器官良恶性肿瘤的鉴别得到广泛应用。近期一些动物及人体试验中也证明了其在观察椎间盘弥散功能状态的有效性及可行性。目的1.通过建立犬同种异体椎间盘模型,研究并描述一种在无内固定辅助条件下建立犬同种异体椎间盘移植模型的手术技术。2.利用DCE-MRI技术及病理学观察对移植术后动物进行随访,观察移植椎间盘内弥散功能状态的动态变化,探讨其生物功能的变化情况。方法：1.选取1岁龄健康杂种犬25只,(10-15月龄,10-14kg),雌雄不限,进行X线及MRI对椎间盘整体情况进行评价,通过Pfirrmann分级筛选出无明显脊柱畸形,椎间盘整体情况良好的动物作为实验对象。2.注射过量戊巴比妥钠处死其中的5只犬,在无菌条件下取L1-L6椎间盘共25个放入预先配置好的冻存液中,逐级冻存,步骤为4℃(12h)、-20℃(2h)、-40℃(2h)、-80℃(2h),最后放入液氮中保存。剩余20只犬用于建立L5-L6椎间盘移植模型的研究。3.术前、术后1、4、6、8、12周进行腰椎正侧位X线检查,观察移植椎间盘的位置以及与相邻椎体的愈合情况,测量术后各时间点椎间盘高度数值,以x±s表示,并采用方差分析(ANOVA)分别与术前测量的椎间盘高度进行对比。以P0.05为有统计学差异。4.术后4、8、12、24周对移植成功的动物进行DCE-MRI观察,每次扫描的时间点为静脉注射造影剂(0.3 mmol/kg)后0 min,2 min、5 min、10 min、30 min、 60min、90min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min,扫描序列为T1 FSE,3.0 T。选取椎间隙上下椎体、上下终板区域及髓核五个区域的感兴趣区间,对感兴趣的间隔不同时间点测量感兴趣区域(Region Of Interest ROI)的信号强度值,并计算增强率。根据结果绘制各感兴趣区间的时间-信号增强率曲线,观察各曲线的变化特点,并对其进行分析。5.术后12周、24周处死半数实验动物,获得移植节段椎间盘及上下约5mm的椎体骨性结构,放入4%的多聚甲醛中固定2周,然后放入配制好的Perenyi's脱钙液中脱钙4周,最后进行石蜡包埋,切片后行HE染色及Masson染色,观察椎间盘内髓核、终板及纤维环的形态结构等。结果1.椎间盘移植手术前选取合适大小的供体椎间盘,术中注意保留前、后纵韧带及对侧纤维环,可以实现在无内固定条件下成功建立同种异体椎间盘移植模型。本研究中椎间盘移植成功17例,其余2例出现椎间盘脱出,1例出现椎间盘炎。2.术后3月影像学检查示移植椎间盘的上下终板与相邻椎体形成骨性愈合,未出现移位及脱出。影像学测量移植术前椎间盘高度为：3.0±0.7mm,术后1、4、6、8、12周椎间盘高度分别为：2.9±0.3mm、2.7±0.6mm、2.7±0.4mm、2.6±0.8mm、 2.6±0.7mm;椎间盘高度的每个时间点平均值均低于术前,但差异无统计学意义(P0.05),随着观察时间的增加,椎间盘的高度略有下降趋势,但各组间椎间盘高度平均值无明显统计学差异(P0.05)。3.大体标本观察发现,可见术后12周时移植椎间盘与椎体已形成骨性愈合,愈合区域仍可辨认,局部无明显免疫炎症反应表现。术后12周及24周的移植椎间盘与对照组相比均发生了一定程度的退变,椎间盘高度降低,髓核组织部分变性,纤维环结构与髓核组织分界不清,纤维环同心圆排列结构清楚,部分存在缺损,但两个实验组间无明显差别。4.病理学观察中,与对照组相比,术后12周时髓核组织结构松散,排列紊乱；内层纤维环部分断裂,大体结构仍较完整；软骨终板增厚。术后24周时纤维环结构紊乱,髓核组织部分纤维化,软骨终板无明显退变。5.术后4、8、12、24周各感兴趣区间时间-信号增强率曲线中,正常终板、髓核及椎体均出现两个峰值,之间存在统计学差异(P0.05)。术后4周移植椎间盘终板及髓核的分别于90 min和120 min达到峰值后出现波动,未观察到第二峰值出现,增强速率及增强率最大值均低于对照组。术后8周移植椎间盘终板及髓核的均于120 min达到峰值后出现波动,未观察到第二峰值出现,其增强速率及增强率最大值均低于对照组。术后12周各感兴趣区间时间-信号增强率曲线中,移植椎间盘终板、髓核信号增强率均在120 min时达到峰值,然后开始缓慢下降,未出现第二个峰值,增强速率及增强率最大值较前提高但仍均低于对照组。术后24周各感兴趣区间时间-信号增强率曲线中,移植椎间盘终板、髓核信号强度分别在30 min及90 min时达到峰值后逐渐下降,均在150 min时再次开始增高,210 min时达到第二个峰值,两个峰值之间存在统计学差异(P0.05)。结论：1.术前通过腰椎横突进行体表定位,可以保证手术节段的准确性。采用恰当的手术技术,有助于在无内固定辅助下成功实施同种异体椎间盘移植手术。选择合适大小的供体椎间盘,有利于提高手术成功率及降低术后移植椎间盘移位及脱出风险。本研究提供了一种建立犬同种异体椎间盘移植模型的可行的手术方案。2.术后4、8周实验组DCE-MRI观察提示椎间盘弥散功能受到了一定的影响,主要原因考虑是移植间盘与宿主椎体未形成骨性愈合,椎体与终板之间的血管襻网未完全吻合,造影剂到达终板时间延长,同时由于椎间盘代谢速率下降,导致240 min内未观察到第二峰值出现。3.术后12周实验组DCE-MRI观察提示椎间盘弥散功能与之前相比得到了一定的恢复,但与正常椎间盘仍有区别,主要原因考虑是移植椎间盘与椎体形成了骨性愈合,终板与椎体之间的血管网完成了重建,因此造影剂到达终板的速度较前加快,但由于手术造成前期椎间盘营养供应障碍,导致髓核细胞活性降低及细胞外基质减少,对其代谢功能造成了一定影响,故仍未观察到第二峰值出现。4.术后24周实验组DCE-MRI观察提示移植椎间盘的终板功能已接近正常,尽管终板及髓核增强率最大值仍小于对照组,但均可在210 min时观察到第二峰值出现,说明移植手术未造成终板结构破裂缺损情况。尽管移植手术对早期椎间盘弥散功能存在一定影响,并会降低髓核细胞活性,但在没有损害终板的前提下,椎间盘的弥散功能可以得到基本的恢复。总的来说,同种异体椎间盘移植技术作为治疗椎间盘退行性疾病的方法,可以在一定程度上恢复椎间盘的稳定性、活动度及生物活性。通过动态对比增强核磁共振对术后的观察随访中发现,早期椎间盘内营养物质的弥散功能受到了一定的影响,但随着血管网的重建、终板功能的恢复,椎间盘的代谢功能基本得到了恢复。这不仅探讨了同种异体椎间盘移植术后终板功能的动态变化对椎间盘弥散能力的影响,也为将来同种异体椎间盘移植在临床中的开展提供了可靠的依据。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R687.3

【共引文献】