重组腺病毒介导恒河猴HLA-G基因在恒河猴未成熟树突状细胞中的表达和鉴定

发布时间：2019-05-31 13:32

【摘要】：[目的]构建恒河猴HLA-G过表达腺病毒载体并鉴定；培养筛选恒河猴未成熟树突状细胞(immature dendritic cell, imDC)后用重组腺病毒载体进行转染,western blot检测HLA-G目的基因的表达情况。[方法](一)过表达腺病毒载体构建：将目的载体和含有目的基因的质粒进行酶切,酶切产物电泳回收后进行交换,其产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对结果正确的即为构建成功的目的质粒。(二)目的质粒的表达检测：用恒河猴HLA-G目的基因过表达真核质粒载体转染293T细胞,western btot检测目的质粒的表达情况。(三)AdMax腺病毒包装系统对恒河猴HLA-G过表达腺病毒载体进行包装、扩增,Adeno-X纯化试剂盒纯化病毒,终点稀释法检测腺病毒滴度。(四)恒河猴树突状细胞的培养及腺病毒感染效率检测。(五) Western blot检测HLA-G在恒河猴未成熟树突状细胞中的表达。[结果]通过对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,阳性转化子PCR产物大小为618bp,与理论值相符。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,并且比对结果正确,表明成功构建了目的质粒。目的质粒转染HEK293细胞,经western blot检测,可以观察到18KD附近有特征条带,其大小与目的基因融合蛋白相吻合。结果说明目的基因过表达OK。经终点稀释法测得腺病毒滴度为1×|011/ml。重组腺病毒感染恒河猴未成熟树突状细胞,western blot检测见42KD处出现特异性条带,与目的蛋白大小一致。[结论]通过HLA-G与腺病毒载体连接成功构建恒河猴HLA-G腺病毒载体,后续用重组腺病毒载体感染未成熟树突状细胞,经western blot检测HLA-G可以在恒河猴imDC中稳定的表达。[展望]通过重组腺病毒感染未成熟树突状细胞,希望获得致耐受性树突状细胞,下一步将树突状细胞注射入受体门静脉中研究恒河猴肝移植免疫耐受。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R617

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本文编号：2489741