雷公藤红素上调TMEM100蛋白抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231转移

发布时间：2019-08-01 16:11

【摘要】：乳腺癌,是全世界三大最常见的恶性肿瘤之一(其它两大为肺癌和结肠癌),是女性中最常见、发病率最高的一种恶性肿瘤,严重影响着女性健康。而转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。因此,乳腺癌转移是亟待解决的问题。雷公藤红素(celastrol,Cel)作为一种从传统中药雷公藤中提取的天然化合物,高效低毒,具有广普的抗肿瘤活性,能诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤转移,然而它在抑制乳腺癌转移方面还缺乏足够的认识。TNF-α,是TNF家族中的一员,是一种由巨噬细胞和肿瘤细胞活化产生的多功能促炎细胞因子。研究发现,TNF-α参与多种肿瘤转移过程,具有促进肿瘤转移的作用。本文以Cel对乳腺癌细胞转移以及TNF-α促转移的影响进行研究。本文进行如下的探究:MTT检测MDA-MB-231细胞在Cel和(或)TNF-α作用下处理一定时间后的细胞活性。细胞粘附实验和流式细胞术检测细胞的粘附能力。伤口愈合实验检测细胞的迁移能力。Transwell检测细胞的侵袭能力。小管生成实验检测体外小管生成能力。Western blot检测TMEM100、SMAD1蛋白水平的表达量变化和SMAD1/5的磷酸化。qPCR检测基因ATF2、ACVR1(ALK1)、SMAD4、TGFβ的转录水平表达量变化。本文的研究结果如下:(一)Cel影响乳腺癌细胞转移的实验结果:(1)MTT检测显示:Cel不同浓度处理MDA-MB-231细胞12、24、36 h后,随着药物浓度增大,Cel的抑制作用增强,且具有一定的剂量和时间依赖性。(2)粘附实验结果显示:Cel浓度越大,细胞粘附率逐渐减小,表明Cel能显著抑制MDA-MB-231细胞的粘附能力。(3)流式细胞术结果显示:Cel浓度增大,MDA-MB-231细胞同P-选择素结合的比例减少,进一步表明Cel能显著抑制MDA-MB-231细胞的粘附能力。(4)伤口愈合实验结果显示:随着Cel浓度增大,细胞迁移距离越小,明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力。(5)Transwell实验结果显示:随着Cel浓度增加,穿过膜的细胞数目逐渐减少,这表明Cel显著抑制MDA-MB-231细胞的侵袭能力。(6)小管生成实验结果显示:随着Cel浓度增大,MDA-MB-231细胞形成小管的数目减少,且管腔不完整程度增大,表明Cel能抑制MDA-MB-231细胞体外小管生成。(7)Western blot结果显示:Cel促进TMEM100、SMAD1蛋白表达,同时增强SMAD1/5的磷酸化。(8)qPCR结果显示:Cel促进ACVR1基因表达,下调TGFβ信号通路相关基因表达。(二)Cel影响TNF-α促转移初探实验结果:(1)MTT检测显示:TNF-α能够促进MDA-MB-231细胞活性,而Cel浓度越大,则越显著地抑制其对MDA-MB-231细胞活性的促进作用。(2)细胞粘附实验结果显示:TNF-α增大MDA-MB-231细胞的粘附率,表明TNF-α能增强MDA-MB-231细胞粘附能力;而加入Cel后粘附率显著下降,这表明Cel抑制TNF-α对MDA-MB-231细胞粘附的促进作用。(3)流式细胞术结果显示:TNF-α促进P-选择素/MDA-MB-231细胞结合,进一步表明其能促进细胞粘附;而Cel加入后则显著降低P-选择素/MDA-MB-231细胞结合,进一步表明Cel能抑制TNF-α对MDA-MB-231细胞粘附的促进作用。(4)伤口愈合实验结果显示:TNF-α处理增大细胞的迁移距离,表明TNF-α能增强MDA-MB-231细胞的迁移能力;而Cel浓度越大,则减少TNF-α诱导的细胞迁移距离,表明Cel能够抑制TNF-α对MDA-MB-231细胞迁移能力的促进作用。(5)Transwell实验结果显示:TNF-α作用增加穿过膜的细胞数目,表明其促进MDA-MB-231细胞侵袭;而Cel可明显减少穿过膜的细胞数目,表明Cel可抑制TNF-α对MDA-MB-231细胞侵袭能力的促进作用。(6)小管生成实验结果表明:TNF-α能促进小管形成;而加入Cel后,小管数目显著减少,且管腔不完整,表明Cel可抑制TNF-α诱导的MDA-MB-231细胞体外管腔形成。(7)qPCR结果显示:TNF-α上调TGFβ信号通路相关基因表达,而Cel抑制TNF-α对TGFβ信号通路相关基因的上调。通过以上两部分实验,我们初步得到Cel抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移,同时抑制TNF-α促进乳腺癌细胞MDA-MB-231的转移。Cel通过促进SMAD1/5的磷酸化,增强ACVR1/SMAD1/5信号,促进TMEM100表达,从而抑制乳腺癌转移。此外,Cel在转录水平上抑制TGFβ信号通路,促进TMEM100表达。Cel通过下调TGFβ信号抑制TNF-α对乳腺癌细胞转移的促进作用。因此,本文对Cel在抗乳腺癌的转移以及抑制TNF-α促转移机理进行初步研究,为Cel在抗肿瘤领域的应用提供依据,为Cel的临床癌症治疗奠定基础。
【图文】：

实验技术路线

腺癌细胞 MDA-MB-231 常规培养的细胞形tured morphology of human breast cancer cells胞 MDA-MB-231 转移 293-T 细胞活性的影响0.5、1、2、4、8 μmol·L-1的 Cel 分别处其细胞活性。如图 3-2 所示，，Cel 处理
【学位授予单位】：西华师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】

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本文编号：2521854