基于同位素标记相对和绝对定量技术核因子-κB必需分子结合的小分子多肽改善肿瘤坏死因子-α抑制成骨细胞分化的蛋白质组学研究

发布时间：2019-08-19 12:33

【摘要】：骨的代谢及形成障碍大部分是由感染他等因素造成的炎症反应直接干扰,而炎症反复影响,长期存在。在中国,每年骨折患者约有5000万例,其中骨折不愈合的发病率约为5%-10%,主要因为骨折内固定术后或开放性骨折术后继发感染或其它因素引起持续的炎症反应的导致。骨折的愈合过程,即坏死骨碎片溶解加上骨基质大量形成、矿化的过程。其过程主要包括成骨细胞的成骨和破骨细胞的溶骨。两者的作用相互拮抗制约,达到一定的动态平衡。一般情况下,创伤骨折或骨病中的炎症反应能刺激机体启动生理功能,抵抗并排除损害因素,修复损伤的骨组织,促进骨折的愈合。但是组织长期过度地受炎性损害,机体难以形成骨质,甚至遭受骨质的进一步破坏溶解。近些年来,越来越多的科学家开始研究有关炎性因子与成骨细胞和破骨细胞之间的关系,其中慢性持续性的炎症可加快骨吸收过程的相关研究已较为成熟。然而在另一方面,慢性持续性的炎症对成骨细胞的代谢的作用尤其是对成骨细胞分化相关的研究尚未成熟,其相互作用与具体机制至今未明确。成骨细胞分化涉及多条细胞信号通道转导机制,某些通路之间存在相互交谈(cross talk)、相互影响,在炎症刺激下其调节过程更为复杂精细,即使研究某一条或多条通路也难以明确成骨细胞在炎症刺激下的形成及分化过程。在未来的生物医学研究里,从多个炎症发展阶段、多个细胞信号通路靶点进行干预和控制炎症才是骨再生研究的发展方向。通过深入研究炎症对成骨细胞分化的影响及其相关干预机制,并在炎症通路下找出特异性的可控靶点,才能多层次多靶点的控制炎症,促进成骨分化,实现抗炎、促成骨的新药物的开发。蛋白质组学研究技术的成熟导致后基因组时代的到来,蛋白质是生物功能更直接的执行者,成为现今生命科学领域中的研究热点。蛋白质组学技术定义是：对机体、组织或细胞的所有蛋白质的表达水平、功能及它们之间的相互作用关系进行高通量的筛选和定量定性分析,比以往通过单个基因、蛋白来研究疾病的诊疗更加可靠,机体状态的反映更准确。运用传统的生化技术,如基于双向凝胶电泳分析-质谱鉴定技术,逐个地去研究大量的蛋白质,筛查检测的工作量庞大而难以完成,更别说从中发现新的发病机制。iTRAQ技术比起传统的技术如2-DE,具有更高通量和高灵敏度的分析能力,运用在比较蛋白质组学研究中具有突出的优势。通过比较机体在健康和炎症状态下的成骨分化的蛋白质表达的差异变化,能获得大量候选标志物蛋白。然而,这些大量候选标志物蛋白与疾病的发生发展过程的更明确的关系及其特异性检测验证是目前研究生物标志物工作的一大难题。基于质谱的多反应监测(Multiple Reaction Monitoring, MRM)技术验证和检测进行生物标志物,可以通过高灵敏度质谱技术挑选出目标蛋白。该技术并不需进行合成特异性抗体,因此比起RT-PCR和Western-blot等需要抗体检测的技术,其更具有优势。使用不同水平的验证技术研究,验证基于iTRAQ技术NBD多肽改善TNF-α抑制成骨细胞分化的蛋白质组学分析鉴定结果是否可靠,能明确进一步研究的可行性,同时也能更全面地认识炎症刺激下成骨细胞分化机制及差异标记物蛋白的功能性质,为后续标志物的验证、功能验证建立基础,所以非常必要。本实验研究包括三部分内容：第一章NBD多肽改善TNF-α抑制成骨分化模型建立及验证C2C12细胞经BMP-2诱导进行成骨分化,炎症刺激物TNF-α抑制C2C12肌原细胞的成骨分化,NBD多肽在炎症刺激影响成骨分化过程中抑制炎症反应。实验的细胞培养完成后将进行组织化学染色检测ALP活性及ALP荧光定量分析以此来验证模型的有效性。以此作为下一步iTRAQ技术的蛋白组学实验分析建立基础。第二章基于iTRAQ技术NBD多肽改善TNF-α抑制成骨细胞分化的蛋白质组学分析本部分研究拟使用上一章节中以TNF-α作为炎症刺激物、NBD多肽作为炎症抑制剂作用在BMP2诱导的肌原前体C2C12细胞分化为成骨细胞的模型,将采用iTRAQ化学标签分别标记炎症刺激组、NBD多肽作用组和正常分化组中细胞分离出的蛋白样品,使用多维液相色谱分离-串联质谱来鉴定,从而筛选出潜在的可能与炎症刺激与炎症受抑制下成骨细胞分化过程相关的差异性蛋白。第三章NBD多肽改善TNF-α抑制成骨细胞分化相关的差异蛋白的MRM表达验证本部分研究采用基于质谱的多反应监测(MRM)技术分析差异蛋白,为NBD多肽在改善TNF-α对成骨分化抑制的作用机制的进一步研究及差异蛋白的筛查提供依据。材料方法：1.细胞模型的建立：实验细胞来自小鼠肌源细胞株C2C12。将其分为3组,加入不同刺激物继续培养。①B组,即BMP组,在实验组细胞培养液中加入BMP-2,浓度为100 ng/ml；②BT组,即BMP+TNF组,在实验组细胞培养液中同时加入BMP-2 和 TNF-α, BMP-2浓度为100ng/ml, TNF-α浓度则是5 ng/ml；③BTP组,即BMP+TNF+NBD多肽组。经过碱性磷酸酶(ALP)荧光活性测定及染色测定：检测C2C12成骨分化的情况。将其以5×103个/孔比例接种于24孔板内培养。3天后进行ALP活性用荧光检测试剂盒检测,采用PNPP法测定其ALP的活性,选择波长405 nm,在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度值,记录结果。培养的第7天进行染色实验,按照Alkaline Phosphatase Staining Kit操作说明书进行。2.采用iTRAQ技术及生物信息学分析筛选差异蛋白：细胞的蛋白质经过抽提及定量,使用iTRAQ试剂对其标记及检测。然后进行预备LC/MS/MS分析、强阳离子(SCX)交换,再经过反相液相色谱分离、ESI质谱鉴定。最后对分析数据,检索和鉴定蛋白,筛选出差异蛋白。2.1.差异蛋白生物信息学分析：对差异蛋白进行GO分析、COG注释、GO富集以及Pathway显著性分析,以此来研究差异蛋白密切相关的主要生物功能、代谢途径及信号转导通路。3.MRM:选择目标蛋白Transition筛选后在MRM+EPI模式下验证transition的色谱峰,再经过MRM检测其子离子的峰强度,整合计算离子峰面积,最后比较不同样本中的目标蛋白表达丰度。4.统计分析：采用SPSS统计软件(版本13.0)处理数据。采用单向方差分析比较多组均数,进行方差齐性检验时,若方差齐采用LSD法,方差不齐时则采用Kruskal-Wallis法。检验水准为a=0.05。结果1.ALP染色测定结果结果显示：B组呈现蓝色颗粒分布；BT组与B组相比,其细胞培养孔里呈现出的蓝色颗粒较弱,表明BT组的ALP活性明显降低；BTP组的蓝色颗粒分布比BT组增加。ALP荧光活性测定结果3组成骨细胞的成骨分化活性差异有统计学意义(F=225.80,P=0.00)。各组进行多重比较,BT组比B组成骨细胞的成骨分化活性降低(P0.05),提示TNF-α抑制BMP-2诱导的成骨细胞分化；BTP组相比起BT组,成骨活性明显增强(P0.05)。2.iTRAQ试剂标记3组C2C12肌原细胞(BMP-2, TNF-a, BMP-2+TNF-a+NBD),根据筛选LC MS/MS鉴定分析结果,B组与BT组(b_B_114-VS-e_BT_118)两组达到定量标准(比值≥1.5或≤0.6)的蛋白76个,其中BT组中上调的蛋白质有59个,BT组中下调的蛋白质有17个。BT组与BTP组(b_BT_118-VS-f_BTP_119)两组定量标准(比值≥1.5或≤0.6)的蛋白数有43个,其中BTP组中上调的蛋白质有25个,BTP组中下调的蛋白质有18个。NPC1蛋白共鉴定出3张谱图,经数据库比对分析后均为NPC1蛋白。对BVSBT组间差异蛋白与BT VS BTP组间差异蛋白做交集处理,筛选得到8表达差异的蛋白质,即1)Periostin,2) SERCA3B,3) Scafl,4) Actn2,5) Atp5d,6) Elp2,7) Atp51及8) Npcl。3.通过MRM检测目标蛋白子离子的峰强度,整合计算离子峰面积的大小,从而可以比较目标蛋白在不同样本中的表达差异。成骨分化受到炎症刺激受抑制是,表达上调的蛋白质为E lp2,Atp5d。其中Elp2上升幅度最大；表达下调的为Actn2, Atp51 及Npc1,Atp2a3 (SERCA3B);当加入NBD多肽改善炎症反应,Elp2,Atp5d出现表达下调,其余蛋白质趋向水平化。结论1.NBD多肽改善TNF-α抑制BMP-2诱导的C2C12肌源细胞成骨分化实验可认为改善炎症抑制成骨分化模型,经验证有效。2. iTRAQ技术及生物信息学分析筛选得到8个炎症刺激成骨细胞分化过程中差异蛋白,即Periostin, SERCA3B, Scafl,Actn2, Atp5d, Elp2, Atp51及Npcl,与改善炎症抑制成骨分化有密切关系。3.MRM的验证检测结果与iTRAQ筛查分析的通过比较,两者的分析结果具有一致性。
【图文】：

谱图,丰度,蛋白质,蛋白

＿１１８）两组各个蛋白质丰度Ｗ２为底数，取对逡逑数而作出蛋白质丰度比分布如图２－７。蛋白表达上调的位于横坐标为０的右侧，逡逑表达量下调的位于横坐标０的左侧（红色表示上调，绿色为下调）。达到定量逡逑标准（比值＞１．５或《０．６）的蛋白７６个，其中ＢＴ组中上调的蛋白质有巧个，逡逑ＢＴ组中下调的蛋白质有１７个（表２－４）。图２－８为差异衷达蛋白质代表ＡＣＴＮ２逡逑（ｓｐ｜Ｑ９Ｊ１９１１ＡＣＴＮ２＿ＭＯＵＳＥ）的二级质谱鉴定代表图。ＡＣＴＯ２蛋白共鉴定出２逡逑张谱图，经数据库比对分析后均为ＡＣＴＮ２蛋白。逡逑２７逡逑

丰度分布,丰度分布,蛋白质,蛋白

绿色为衷达量下调）。最终达到严格定量标准（比值＞１．５或《０．６）的蛋白数有逡逑４３个，其中ＢＴＰ组中上调的蛋白质有２５个，ＢＴＰ组中下调的蛋白质有１８个（表逡逑２－４）。图２－８为差巧农达蛋白质代巧ＮＰＣ１邋（ｓｐ｜Ｏ３％０４｜ＮＰＣｌ＿ＭＯＵ化）的二级逡逑质谱鉴定代巧图。ＮＰＣ１蛋白共鉴定出３张谱图，，经数据库比对分析后均为ＮＰＣ１逡逑蛋白。逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｒａｔｉｏ邋边ｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ（ｅ＿ＢＴ＿１１８＂ＶＳ＂ｆ＿ＢＴＰ＿１１９）逡逑ｉｊ邋１逡逑Ｉ邋Ｉ：逡逑Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑－１０逦－５逦０逦５逦１０逡逑ｌｏｇ（ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｒａｔｉｏｓ），ｗｈｈ邋ｂａｓｅ邋＝邋２逡逑图２－７邋ＢＴ组与ＢＴＰ组蛋ｎ质丰度分布逡逑Ｆ＂ｉｇ．２－７邋Ｐｒｏ化ｉｎ邋ｒａｔｉｏ邋ｄｉｓｔｒｉ
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R683

【共引文献】