结蛋白病肌纤维内线粒体膜孔通道蛋白1相关蛋白表达异常的观察

发布时间：2019-09-18 13:48

【摘要】：背景与目的结蛋白基因突变导致的结蛋白病是一种遗传性蛋白聚集性肌病,线粒体异常是结蛋白病最早发生的病理改变之一,然而导致线粒体出现异常的相关机制目前不完全清楚。膜孔通道蛋白1/电压依赖阴离子通道1(VDAC1)是线粒体通透性转化孔(mPTP)的重要调控亚基,当mPTP通透性增高时,大量细胞凋亡因子从线粒体膜间隙释放到胞浆,导致细胞凋亡级联反应。然而结蛋白病与VDAC1是否有明确关系尚无研究明确阐述,本研究通过免疫组化观察结蛋白沉积性肌病患者和结蛋白病动物模型中VDAC1及其相关凋亡蛋白(Bax、ATF2、Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ)的表达,探究结蛋白病肌细胞内线粒体异常的可能机制。方法1.构建腺病毒包装的突变型和野生型结蛋白基因的真核生物表达质粒。2.首次造模:实验组将浓度为1.0×1011pfu/ml包装有突变型结蛋白质粒的腺病毒按九宫格法分九点微量注射到28-35日龄雄性SD大鼠左后大腿肌内,每只大鼠注射总量为100μl。右后大腿对应点注射等量包装有野生型结蛋白基因质粒的腺病毒为对照组。分别于转染后第2、7、14、21、28天各处死2只大鼠,取注射点处的肌肉行肌肉冰冻切片常规染色及desmin免疫组化染色。对比观察出现以结蛋白沉积为主要改变的典型结蛋白病病理改变的转染后天数,以确定造模条件。3.重复造模:根据上述的实验结果,将突变结蛋白基因的腺病毒微量注射4只28-35日龄雄性SD大鼠(方法同上),在已观察到的出现以结蛋白沉积为主要改变的转染后天数取注射区局部肌肉,行冰冻切片desmin免疫组化染色,观察模型的稳定性。4.将造模成功动物模型与结蛋白沉积性肌病患者骨骼肌行常规病理及免疫荧光双标染色,对比观察VDAC1及其相关凋亡蛋白(Bax、ATF2、Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ)的表达。结果1.首次造模发现转染后第14天,2只SD大鼠实验组的转染局部肌肉的肌纤维内均出现结蛋白沉积等典型结蛋白病病理改变;取4只SD大鼠重复造模,在转染后第14天观察到有3只大鼠实验组转染局部肌肉的肌纤维内出现结蛋白沉积等典型结蛋白病病理改变。2.结蛋白沉积性肌病患者与结蛋白病动物模型均在结蛋白沉积的肌纤维内出现VDAC1、促凋亡蛋白(Bax、ATF2)聚集高信号,而抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ)无聚集。其中结蛋白沉积性肌病患者的结蛋白沉积肌纤维内Bcl-2、Bcl-xl较正常肌纤维信号无明显变化,HKⅡ较正常信号略低;结蛋白病动物模型的结蛋白沉积肌纤维内Bcl-2较正常信号略低,Bcl-xl、HKⅡ较正常肌纤维信号无明显变化。结论1.我们以腺病毒包被突变结蛋白基因以直接肌肉注射转染方式成功构建出结蛋白病动物模型,验证模型稳定性高。2.结蛋白病的发生可能与线粒体相关性促凋亡蛋白(Bax、ATF2)的活化,抑制抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xl、HKⅡ)的表达,刺激VDAC1开放、高表达,进而诱导凋亡因子从线粒体膜间隙释放到胞质,导致细胞凋亡级联反应有关。
【图文】：

第 2章 材料与方法则取消第 3 次注射；如未达到麻醉效果则继续注射。注射完麻醉药物后，轻微旋转拔出针头，防止漏液[25]。麻醉成功后，双后大腿备皮，用记号笔在双后大腿皮肤画九宫格，每小格长度约 0.3cm×0.3cm（图 1）。用碘伏消毒局部后，实验组取左后大腿用微量注射器行肌肉微量注射浓度为 1.0×1011pfu/ml 包被突变 desmin 基因的腺病毒液（rAd5-DES-L274P），每只大鼠注射总量为 100μl，按九宫格平均分为 9 点注射。相对应部位的右大腿肌肉注射等量包被野生型 desmin 基因的腺病毒液（rAd5-DES-wild）为对照组。

图 2：转染后大鼠在转轮中自由奔跑。2.2.3 实验标本的取材及后处理(1).分别于转染后第 2 天、7 天、14 天、21 天、28 天各断颈处死 2 只。(2).注射局部备皮后用组织剪剪开双后大腿注射点局部皮肤，取注射处肌黄耆树胶固定于软塞，避免倾倒。(3).在 100ml 长柄量勺中倒入 70-80ml 异戊烷。(4).装有异戊烷的量勺放入液氮中。(5).大镊子搅动异戊烷，使异戊烷充分冷却。(6).大镊子夹住标本，将标本放于液态异戊烷中轻微晃动，降温 20 秒。(7).冻结好的标本放于-80℃冰箱保存，以备做后期的冰冻切片和免疫。(8).组织经免疫组化染色观察，选择出现典型结蛋白病病理改变的时间点
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R685

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本文编号：2537538