神经干细胞联合GABA能神经元移植治疗大鼠海水浸泡脑损伤的初步研究

发布时间：2019-11-03 04:25

【摘要】：目的:1.探求单因素抑制Hesl基因表达对人GABA能神经元细胞诱导分化率的影响,寻求一种简单高效的诱导方法。2.改进海水浸泡脑损伤大鼠模型制作方法,以求更好的模拟海水浸泡脑损伤。3.观察海水浸泡脑损伤大鼠不同时间段脑内炎症表现,探寻细胞移植治疗的适当时间。4.神经干细胞(NSCs)联合γ-氨基丁酸(GABA)能神经元细胞联合移植治疗对海水浸泡脑损伤大鼠的神经功能损伤的修复作用。方法:在含有10%胎牛血清的普通分化培养基中添加寡核苷酸链“anti-hesl”组成诱导分化培养基,在相同条件下利用诱导分化培养基和普通分化培养基诱导人神经干细胞分化为GABA能神经元细胞,染色鉴定。对外伤性脑损伤(TBI)大鼠模型的撞针进行相应改进,通过灌肠袋定点滴注的方式模拟海水浸泡,观察不同浸泡时间对大鼠损伤程度的影响。按改良方法对大鼠进行造模,造模成功后第24、48、72、96小时灌注取脑组织并进行常规HE染色及针对小胶质细胞的DAB显色。观察局部组织的炎症反应及中枢系统免疫反应中小胶质细胞的活化,聚集,分布变化。将NSCs及其诱导的GABA能神经元细胞在改良海水浸泡脑损伤大鼠模型建立后第4天通过立体定向的方式将其移植至大鼠脑内,同样造模及移植方法对模型大鼠进行单纯神经干细胞移植,同时设置单纯海水浸泡脑损伤组而不进行细胞移植。观察各组大鼠行为学表现及脑组织切片中移植细胞的存活及分布情况。结果:1.诱导第14天90%-95%细胞已完成分化。实验组GABA分化率64.0%,对照组仅16.6%,统计学分析P0.01。2.TBI大鼠模型海水浸泡30及45分钟组存活率100%,60分钟组存活率20%。神经功能缺失3级以上,模型45分钟组为80%,明显高于其他两组。3.大鼠脑损伤后48-72小时:出血,水肿加重;小胶质细胞聚集,活化,其数量较其他时段明显增高,并有明显的吞噬行为。72-96小时脑出血及水肿情况逐渐稳定,小胶质细胞数量减少。4.细胞治疗组神经功能较单纯损伤组均有明显改善。联合治疗组与神经干细胞治疗组相比,在第14—31天神经功能评分(mNSS)优于神经干细胞治疗组(P0.05),在第21天偏瘫实验(LUA)结果优于神经干细胞治疗组(P0.05)。结论:1.抑制Hesl基因的表达可显著提高人NSCs诱导分化为GABA能神经元的分化率。2.改良海水浸泡脑损伤大鼠模型可以较好模拟海水浸泡脑损伤特点,满足科研需要。3.脑损伤海水浸泡后72小时内炎症反应最为强烈,小胶质细胞大量聚集活化,72-96小时后逐渐减弱并趋于平稳。4.NSCs与GABA能神经元联合移植对于海水浸泡脑损伤大鼠的运动功能恢复有较好疗效,但对其记忆功能恢复效果仍有待探究。
【图文】：

神经干细胞,人类,诱导分化,细胞

球体中心细胞缺少氧气及营养而发生坏死，因此及时进行传代培养。传逡逑代后细胞增殖迅速，再次迅速形成新的细胞球体并迅速增大。培养至第１０天，逡逑约７０％以上的细胞球体直径再次达１５０－２００ｕｍ邋（图１－ｌａ）。获得第二代神经干细逡逑胞。细胞球ｎｅｓｔｉｎ染色阳性（图１－ｌｂ），证实为神经干细胞球。逡逑■Ｈｌ｜｜逡逑１－ｌａ逦ｌ￣ｌｂ逡逑图１－１：人类神经干细胞球逡逑ａ为１００邋（１０＊１０）倍镜下神经干细胞球，ｂ为２００邋（１０＊２０）倍镜下神经干细胞ｎｅｓｔｉｎ逡逑免疫荧光鉴定。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋ｈｕｍ邋ａｉｌ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ逡逑ａ．邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｈｕｍａｎ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ邋（１０＊１０）邋ｂ．邋ｈｕｍａｎ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ逡逑ｓｔａｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｎｅｓｔｉｎ邋（１０＊２０）．逡逑１．２．逦２邋ＧＡＢＡ能神经元诱导分化逡逑１．２．逦２．１培养观察逡逑取第二代神经干细胞球进行诱导分化培养。诱导分化培养液诱导分化２天后逡逑即可见细胞开始贴壁生长，但大部分细胞仍处于悬浮状态。第４天，，约半数细胞逡逑开始贴壁，少数细胞胞体开始出现棱角。第６天，多数细胞开始贴壁生长，部分逡逑细胞伸出１－２个长突起，但细胞出现汇聚性贴壁现象（图ｌ＿２ａ箭头处），为不影逡逑响细胞后续分化生长，再次予以胰酶消化，离心，并重新接种。普通分化培养液逡逑组培养至第４天时同样可见约半数细胞开始贴壁生长，至第６天，贴壁细胞增多，逡逑细胞形态各异

人类,神经干细胞,诱导分化,细胞

球体中心细胞缺少氧气及营养而发生坏死，因此及时进行传代培养。传逡逑代后细胞增殖迅速，再次迅速形成新的细胞球体并迅速增大。培养至第１０天，逡逑约７０％以上的细胞球体直径再次达１５０－２００ｕｍ邋（图１－ｌａ）。获得第二代神经干细逡逑胞。细胞球ｎｅｓｔｉｎ染色阳性（图１－ｌｂ），证实为神经干细胞球。逡逑■Ｈｌ｜｜逡逑１－ｌａ逦ｌ￣ｌｂ逡逑图１－１：人类神经干细胞球逡逑ａ为１００邋（１０＊１０）倍镜下神经干细胞球，ｂ为２００邋（１０＊２０）倍镜下神经干细胞ｎｅｓｔｉｎ逡逑免疫荧光鉴定。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１．邋ｈｕｍ邋ａｉｌ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ逡逑ａ．邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｈｕｍａｎ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ邋（１０＊１０）邋ｂ．邋ｈｕｍａｎ邋ｎｅｕｒｏｓｐｈｅｒｅ邋ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ逡逑ｓｔａｉｎｅｄ邋ｂｙ邋ｎｅｓｔｉｎ邋（１０＊２０）．逡逑１．２．逦２邋ＧＡＢＡ能神经元诱导分化逡逑１．２．逦２．１培养观察逡逑取第二代神经干细胞球进行诱导分化培养。诱导分化培养液诱导分化２天后逡逑即可见细胞开始贴壁生长，但大部分细胞仍处于悬浮状态。第４天，约半数细胞逡逑开始贴壁，少数细胞胞体开始出现棱角。第６天，多数细胞开始贴壁生长，部分逡逑细胞伸出１－２个长突起，但细胞出现汇聚性贴壁现象（图ｌ＿２ａ箭头处），为不影逡逑响细胞后续分化生长，再次予以胰酶消化，离心，并重新接种。普通分化培养液逡逑组培养至第４天时同样可见约半数细胞开始贴壁生长，至第６天，贴壁细胞增多，逡逑细胞形态各异
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R651.15

【参考文献】