老龄小鼠术后认知功能障碍与海马中microRNA异常表达的相关性研究

发布时间：2019-11-14 02:48

【摘要】：术后认知功能障碍(POCD)是老年患者术后常见并发症,表现为学习、记忆等认知功能下降,增加并发症和死亡率。目前研究认为,POCD的发病机制主要为中枢神经炎症、氧化应激、胆碱能系统失调、β淀粉样蛋白沉积等因素引起的神经元凋亡增加、再生减少、突触可塑性下降等神经退行性改变。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA,通过与靶基因mRNA的3'非翻译区(3'UTR)结合发挥转录后调控作用,在中枢神经系统中含量丰富,对神经元发育、分化,突触联系和树突棘形成等有重要调节作用。研究发现,高龄、应激、炎症反应、缺血再灌注损伤等伤害性刺激可导致miRNA表达异常,且miRNA通过调节神经元突触可塑性参与阿茨海默病(AD)、精神分裂症、抑郁症等认知障碍性疾病的发病过程。基于上述发现,我们推测,术后学习记忆等认知损害的发病机制之一可能是海马中miRNA异常表达导致突触可塑性下降。故本研究拟通过相关的实验设计探讨老龄小鼠海马中miRNA的异常表达与其术后认知功能损害的相关性。第一部分不同麻醉手术方式对老龄小鼠术后认知功能的影响及海马突触可塑性情况的观察目的:探讨异氟醚吸入麻醉和腹部手术对老龄小鼠术后认知功能的影响,以及术后海马神经元突触可塑性变化情况。方法:实验一:老龄C57BL/6小鼠(18月龄、64只)按体重排序,随机分为4组:对照组(con)、异氟醚组(iso)、手术组(sur)、异氟醚+手术组(iso+sur),每组16只,分别施以假手术、1.8%异氟醚吸入1.5h、局麻腹部手术、1.8%异氟醚吸入1.5h+局麻腹部手术处理,并于术前行旷场实验、术后行Morris水迷宫实验和条件恐惧实验评价各组小鼠学习记忆功能。实验二:老龄C57BL/6小鼠(18月龄、48只)随机分为4组,每组12只,分组和处理因素同实验一,于术后第3、7天处死各组小鼠取脑组织,行免疫荧光染色观察海马组织突触体素-1(SYN-1)表达情况,行蛋白印记实验检测突触后致密95(PSD95)的相对表达量。结果:实验一:旷场实验中,各组小鼠跨越方格数和后脚站立次数相比均无明显差异(P0.05)。Morris水迷宫实验中,与对照组相比,手术组小鼠术后水迷宫登台潜伏期延长(P0.05),目标象限停留时间缩短(P0.01)、穿台次数减少(P0.05);而与手术组相比,异氟醚组和异氟醚+手术组登台潜伏期缩短(P0.05),目标象限停留时间增加(P0.05)。条件恐惧实验中,与对照组相比,手术组小鼠术后第1、3、7天场景测试凝滞时间百分比降低(P0.05),术后第3天声音测试凝滞时间百分比降低(P0.05);与手术组相比,异氟醚组术后第3天场景测试凝滞时间百分比和声音测试凝滞时间百分比均增加(P0.05),异氟醚+手术组术后第3、7天场景测试凝滞时间百分比增加(P0.05)。实验二:免疫荧光染色发现,与其他各组相比,术后第3天手术组小鼠海马组织SYN-1表达下降,突触密度减少(P0.05),术后第7天各组相比无显著差异(P0.05)。蛋白印记实验发现,与对照组相比,手术组小鼠海马组织PSD95术后第3天表达量降低(P0.05),与手术组相比,异氟醚组小鼠海马PSD95术后第3天表达量增加(P0.05);各组小鼠海马PSD95术后第7天表达量无显著差异(P0.05)。结论:腹部手术可致老年小鼠术后早期空间学习记忆能力和关联学习记忆能力发生损害,海马神经元突触可塑性下降,而异氟醚吸入麻醉可部分逆转腹部手术造成的认知损伤和突触可塑性下降,具有保护作用,进一步证实POCD的发病机制之一是突触可塑性下降所致。第二部分术后认知功能障碍老龄小鼠海马组织microRNA表达差异分析与初步验证目的:比较和分析术后认知功能障碍老龄小鼠海马组织microRNA表达变化情况,并初步探索其影响认知功能的可能机制。方法:实验一:老龄C57BL/6小鼠(18月龄、28只)按体重排序,随机分为2组:对照组(con)和手术组(sur),每组14只,分别施以假手术和局麻腹部手术。术后24h每组随机抽取3只小鼠处死取海马组织,抽提总RNA,行miRNA microarray基因芯片检测两组小鼠海马miRNA表达情况;每组随机抽取3只小鼠处死,抽提海马总RNA,液氮保存以备qRT-PCR验证实验;每组剩余8只小鼠行Morris水迷宫实验评价认知功能。实验二:对实验一 miRNA microarray基因芯片中筛选出的miRNA(表达变化1.5倍以上)利用miRanda,miRDB,miRWalk等数据库进行靶基因预测,并行GO分析及KEGG通路预测;对基因芯片筛选出的miRNA随机抽取若干(miR-16-3p, miR-290a-5p, miR-217-5p,miR-382-3p, miR-466b-3p, miR-183-5p)行qRT-PCR验证芯片结果。实验三:老龄C57BL/6小鼠(18月龄、36只)按体重排序,随机分为4组:对照组(con)、异氟醚组(iso)、手术组(sur)、异氟醚+手术组(iso+sur),每组9只,分别施以假手术、1.8%异氟醚吸入1.5h、局麻腹部手术、1.8%异氟醚吸入1.5h+局麻腹部手术处理,于术后第1、3、7天每组随机处死3只小鼠取海马组织,对与认知功能相关的 miRNA(miR-155-5p,miR-582-5p, miR-134-5p)行 qRT-PCR检测,对上述miRNA预测的靶蛋白环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB),脑源性神经营养因子(BDNF)行Western Blot检测。结果:实验一: miRNA microarray基因芯片检测发现,与对照组相比,腹部手术后24h,手术组小鼠海马组织miRNA表达上调1.5倍以上的有29个,表达下调1.5倍以上的有34个。Morris水迷宫实验发现,腹部手术造成老龄小鼠术后登台潜伏期延长(P0.05),目标象限停留时间缩短(P0.01)、穿台次数减少(P0.05),空间学习记忆能力下降。实验二:通过对实验一中筛选的表达改变1.5倍以上的miRNA进行靶基因预测发现,有36个miRNA与creb1(CREB基因)的表达有关,有23个miRNA与bdnf(BDNF基因)的表达有关。qRT-PCR实验显示,随机抽取的miR-16-3p,miR-290a-5p, miR-217-5p,miR-382-3p, miR-466b-3p,miR-183-5p 的表达情况与基因芯片检测的结果相比,差异无统计学意义。对筛选的miRNA行GO分析发现,涉及生物学途径(BP)的GO Term有447个,涉及分子功能(MF)的GO Term有74个,细胞定位(CC)的有36个,多与炎症、神经细胞发育分化、突触形态和功能有关;行KEGG通路预测发现有多条与认知功能有关的信号通路被激活,如神经营养因子信号通路(Neurotrophin signaling pathway)、环腺苷酸信号通路(cAMP signaling pathway)、长时程增强(Long-term potentiation)、丝裂原活化蛋白激酶通路(MAPK signaling pathway)等。实验三:选取与CREB和BDNF表达调控均有关的3个miRNA,即 miR-155-5p, miR-582-5p,miR-134-5p 行 qRT-PCR检测发现,与其他各组相比,术后第1天,该3个miRNA在手术组小鼠海马中表达明显增高(P0.05),术后第3天miR-155-5p表达依然增高(P0.05),其余miRNA表达差异无统计学意义,术后第7天各组小鼠海马组织miRNA表达基本无差别。WestemBlot实验发现,与其他各组相比,术后第1、3天,手术组小鼠海马组织CREB活性降低,第7天各组CREB活性差异无统计学意义;术后第3、7天,与其他各组相比,手术组小鼠海马组织BDNF表达量减少。结论:腹部手术可致老龄小鼠术后认知功能发生损害,与术后早期海马中miRNA表达谱改变有关。手术引起的创伤、中枢炎症、氧化应激、缺血再灌注损伤等,使机体通过上调或下调miRNA的表达,对神经元的生长和凋亡、突触的形态和功能、胶质细胞活化等多条信号通路进行调控,影响突触可塑性,进而影响认知功能。其中,microRNA-CREB-BDNF通路可能是POCD发病机制之一。
【图文】：

小鼠,毛发,躯干,四肢

院动物伦理委员会许可。逡逑实验用小鼠的排除标准是：１．小鼠头、躯干、四肢形态异常者；２．活动明显不协逡逑调者；３．毛发色泽欠佳或脱毛者。见图１－１。逡逑擙逡逑图１－１成年与老年Ｃ５７／ＢＬ６小鼠逡逑１７逡逑

示意图,小鼠,随机抽取,示意图

逡逑图１－２实验一示意图小鼠分４组（ｎ＝１６），，术前行旷场实验（ＯＦｌ＞术后行Ｍｏｒｒｉｓ水迷宫实验逡逑（ＭＷＭ）和条件恐惧实验（ＦＣＴ）邋ｃｏｎ：对照组；ｉｓｏ：异氟酿组；ｓｕｒ：手术组；ｉｓｏ＋ｓｕｒ：异氟酸＋手术组；逡逑ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ：行异氟越吸入处理；ｓｕｒｇｅｒｙ：行腹部手术处理逡逑实验二：老龄Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（１８月龄、４８只）按体重编号，ＣＨＩＳＳ软件随机分为逡逑４组，每组１２只，分组和处理因素同实验一。实验流程如下（见图１－３），行处理（ｄａｙＯ）逡逑后，于术后第３、７天随机处死各组小鼠取脑组织，行免疫荧光染色观察海马组织突逡逑触体素－ｌ（ＳＹＮ－ｌ）表达情况，行蛋白印记实验检测突触后致密９５（ＰＳＤ９５）的相对表达逡逑量。逡逑逦邋ｊｎｏｎｅ逡逑ｃｏｎ（ｎ邋＝邋１２）逦１邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ逡逑逦邋ｄａｙ0逦（ｎ邋＝邋３）逦；邋逦（ｎ邋＝邋３）逦、逡逑逦邋ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ逦ｄａｙ３逦ｄａｙ７逡逑丨丨邋ｓ0＿）逦｜逦＾￣Ｑ＞邋—逡逑逦邋ｓｕｑｅｒｖ逡逑ｓｕｒ（ｎ邋＝邋１２）逦逦＾逦Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逦Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ逡逑逦Ｊ逦Ｌ逦逦ｄａｙＯ逦（ｎ邋＝邋３）逦）逦（ｎ邋＝邋３）逡逑ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ逦ｄａｙ邋３逦ｄａｙ邋７逡逑｜邋＿ｉｓｏ邋＋邋ｓｕｒ（ｎ邋＝邋１２ｊ＿Ｊ逦￣＾逡逑图１－３实验二示意图小鼠分４组（ｎ＝１２）
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R614

【参考文献】