【摘要】：目前器官移植已成为治疗相应器官严重功能障碍的重要手段。肝移植是目前治疗各种终末期肝病唯一有效的方法。免疫抑制剂的使用是预防肝移植术后免疫排斥反应的主要手段,但也能引起患者机体代谢的失衡和许多副作用。如何减少肝移植受者免疫抑制剂的使用,已经成为移植学家们追求的目标。体外光化学疗法(extracorporeal photopheresis,ECP)于1987年引进国内并用于治疗器官移植排斥反应,临床观察到有一定的疗效。ECP是指将患者外周血处理后并从中分离出单个核细胞,再经光敏剂8-甲氧基补骨脂素(8-methoxypsoralen,8-MOP)和长波紫外线(long wave ultraviolet,UVA)联合作用后回输入病人体内的一种血液单采光化学疗法。但ECP作用的具体机制至今尚未清楚。越来越多的证据表明,ECP主要是抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)的功能调节和调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)的诱导作用。在体内凋亡细胞摄取的单核细胞和巨噬细胞可产生免疫抑制调节作用也是ECP发挥负向调节的关键。ECP在以往的研究中主要集中在诱导移植受者的免疫耐受。我们首次用肝移植供者的脾脏和外周血为实验材料,研究脾淋巴细胞的凋亡,和未成熟树突状细胞(imature dendritic cells,imDC)的生成,有一定的创新性且有助于进一步更好的研究受者的免疫耐受机制。本实验就联合应用UVA和8-MOP诱导肝移植供者脾淋巴细胞的早期凋亡,并用供者的外周血经rhGM-CSF、IL-4诱导产生imDC,旨在为进一步研究移植受者的负向免疫调节机制提供理论基础。1、UVA联合8-MOP诱导人脾淋巴细胞凋亡首先获取肝脏移植供者的脾脏(人脾脏来源于解放军第309医院全军器官移植研究所肝胆外科肝脏移植供者,肝源供者已签署相关知情同意书并经309医院伦理委员会批准,符合医学伦理学有关移植的系列规定),制备成淋巴细胞悬液,根据处理方式不同分为单纯UVA处理组(uva组)、单纯8-mop处理组(8-mop组)、uva联合8-mop处理组(联合组)、未经uva照射和未添加8-mop处理组(空白对照组)。每组3例(多次进行反复实验)。uva组于37℃50ml/lco2孵箱中孵育20min,采用照射强度为2j/cm2的光照辐射仪在无菌照射台上照射9min,距uva光源距离为20cm;8-mop组先加入200ng/ml8-mop,再置于37℃50ml/lco2孵箱中孵育20min;联合组先加入200ng/ml8-mop,置于37℃50ml/lco2孵箱中孵育20min后再将此人脾淋巴细胞悬液放于照射强度为2j/cm2,距uva光源20cm的无菌照台上,照射9min;空白对照组仅单纯培养人脾淋巴细胞。将上述不同处理后的人脾淋巴细胞悬液用rpmi1640培养液1200r/min离心5min,反复洗涤2次,再用rpmi1640完全培养基(含100ml/l胎牛血清)重悬细胞悬液,置于37℃50ml/lco2孵箱中培养过夜。24h后用annexinⅤ-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒各组进行染色,用流式细胞仪检测经不同处理后的人脾淋巴细胞的早期凋亡率。2、肝移植供者外周血制备未成熟的树突状细胞首先获取肝移植供者的外周血约10ml(血液来源于解放军第309医院全军器官移植研究所肝胆外科肝脏移植供者,肝源供者已签署相关知情同意书并经309医院伦理委员会批准,符合医学伦理学有关移植的系列规定),等量置于两个15ml离心管内,标记为诱导组和对照组,分别加入等量的人外周血淋巴细胞分离液,分离出单个核细胞,再分别加10mlrpmi1640洗涤两次后,于显微镜下计数活细胞数,保证细胞存活率95%。调整细胞浓度为1×106个/l,分别接种于两个6孔培养板(诱导组6例,对照组6例),置于37℃、5%co2的培养箱中培养2h,清除悬浮细胞,两组均加入rhgm-csf(500u/ml)2ul、rhil-4(1000u/ml)8ul吹打,混匀;48h后两组均半量换液,加入rhgm-csf(500u/ml)1ul、rhil-4(1000u/ml)4ul吹打,混匀;96h后诱导组保持不变,对照组加入rhtnf-α3ul吹打,混匀,培养2天。在培养第6天,光镜下观察各组细胞的形态特征,再分别收取各组的6个培养孔的贴壁细胞。用pe或fitc标记的cd80、cd83、cd11a和cd86抗体,流式细胞仪检测dc的表型。结果发现:1、uva联合8-mop诱导人脾淋巴细胞凋亡:联合组的人脾淋巴细胞的早期凋亡率为(98.45±0.54)%,明显高于其他三组(p0.01)。uva组和8-mop组均高于对照组(p0.01)。各组的总凋亡率和早期凋亡率:联合组的总凋亡率和早期凋亡率分别为(99.36±0.39)%,(98.45±0.54)%;8-mop组分别为(69.55±0.46)%,(64.68±0.74)%;uva组的分别为(65.42±0.36)%,(61.05±0.90)%;对照组分别为(15.53±0.45)%,(13.67±0.54)%。2、肝移植供者外周血制备未成熟的树突状细胞:光镜下可见,培养第6天时,诱导组细胞呈圆形,突起较少,呈现imdc状态。对照组细胞外周可见突起和绒毛,表面结构较完整,树突状结构明显,呈现成熟的树突状细胞(maturedendriticcells,mdc)的状态。流式细胞仪检测树突状细胞的表型:诱导组在培养第6d检测cd80为(22.63±3.56)%,cd86为(16.39±4.72)%,cd83为(8.58±1.72)%,cd11c为(70.56±10.22)%,符合imdc的表现;对照组在培养6d时检测cd80含量为(53.82±5.46)%,cd86含量为(46.65±6.35)%,cd83含量为(80.56±16.45)%,cd11c含量为(82.32±11.61)%,符合mdc的表现。可见,诱导组树突状细胞的cd80、cd86、cd83、cd11c的含量均显著低于对照组(p0.01),且在光镜下呈现出imdc的状态。两组检测指标和细胞的形态相符合。由此可知,用rhgm-csf联合rhil-4的培养方法可成功用肝移植供者的外周血培养出imdc。本实验用ecp方法成功诱导出大量人脾脏凋亡细胞,尤其是早期凋亡细胞,实验结果显著高于其他各个处理组和空白对照组。在体外用rhgm-csf+rhil-4的方法可成功用肝移植供者的外周血培养出imdc,且在光镜下呈现imdc的形态特征。早期凋亡人脾淋巴细胞和imdc在肝移植受者的负向免疫调节作用中至关重要,我们前期的实验已经在大鼠的心脏移植排斥反应中验证了两者之间的相关关系,但在人的相对实验中目前的设备和实验试剂,存在一定缺陷,故其两者反应的具体机制尚未开展,有待进一步实验研究。
【学位授予单位】：河北北方学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 葛志东,周爱武,陈敏珠,徐叔云;脾淋巴细胞α_2-肾上腺素能受体的特征和功能的实验研究[J];中国免疫学杂志;1993年02期
2 董月青 ,姚咏明 ,刘辉 ,董宁 ,于燕 ,盛志勇;烫伤后高迁移率族蛋白B1的变化及其对脾淋巴细胞周期的影响[J];解放军医学杂志;2005年10期
3 吴梧桐;猪胎盘脂多糖对脾淋巴细胞DNA和蛋白质合成的促进作用[J];南京药学院学报;1985年04期
4 孙连仲,隋志仁,于晓春,张桂英;脾淋巴细胞膜表面电荷的辐射剂量效应(简报)[J];白求恩医科大学学报;1982年01期
5 杨宝学,孙凯;硝基呋喃对大鼠脾淋巴细胞非程序DNA合成的诱导作用[J];卫生毒理学杂志;1990年02期
6 ;猪胎盘脂多糖的分离纯化及其对脾淋巴细胞的诱导作用[J];中国药科大学学报;1990年03期
7 路力生,崔正言;人胎脾淋巴细胞的增殖特性[J];中国免疫学杂志;1993年01期
8 张剑军;陈震;石卫东;朱晓燕;刘鲁明;;清胰化积方对移植胰腺癌小鼠免疫抑制因子及脾淋巴细胞功能的影响[J];中国实验方剂学杂志;2008年06期
9 邓伟国,隋志仁;维生素E对脾淋巴细胞膜辐射损伤的作用[J];营养学报;1992年01期
10 陈鸿书,彭家和;猪脾淋巴细胞抑素的提取及其作用机制的研究[J];第三军医大学学报;1979年03期
相关会议论文 前9条
1 王建华;谢丽华;钱瑞琴;刘洪宇;张春英;蔡少青;;玄参中哈巴苷和哈巴俄苷滋阴作用的药理研究[A];全国中药研究与开发学术研讨会论文摘要集[C];2001年
2 邓晓静;陈宝安;丁家华;孙雪梅;董伟民;毕延智;张琰;赵刚;高冲;孙耘玉;王骏;程坚;马燕;宋慧慧;鲍文;Schmitt A;Schmitt M;;移植前供鼠口服受鼠脾淋巴细胞对移植后GVHD影响的实验研究[A];第11次中国实验血液学会议论文汇编[C];2007年
3 刘胜;刘亚普;陈超群;蔡恒玲;罗晶晶;李翔;张艳;;CD4+Foxp3+Treg细胞在幽门螺杆菌感染中作用的初步研究[A];2012全国临床微生物与感染免疫学术研讨会论文集[C];2012年
4 姚远;雷治海;苏娟;杨桂红;;神经肽S及其受体在猪脾淋巴细胞中的表达以及NPS对猪脾淋巴细胞增殖影响的体外研究[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十六次学术研讨会论文集[C];2010年
5 吴玮;范瑞强;余捷凯;yす，
本文编号：2562359
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/waikelunwen/2562359.html
