低氧条件下缺氧诱导因子-1对胎鼠心肌细胞内钙离子转运的影响

发布时间：2019-11-20 06:31

【摘要】：研究背景先天性心脏病(先心病)是目前我国最常见的出生缺陷,严重影响我国的人口质量,增加家庭和社会的负担。随着先心病的诊疗水平不断提高,国内外学者已将先心病的防治延伸到胎儿期,但是未能突破胎儿体外循环的技术障碍,包括良好的胎儿心肌保护,阻碍了胎儿心脏外科的发展。胎儿心肌细胞处于宫内低氧环境,与生后心肌保护可能存在差异。因此,低氧条件下的胎儿心肌保护机制是胎儿心脏外科发展中需要解决的重要环节。目的探讨低氧条件下缺氧诱导因子-1(HIF-1)对胎鼠心肌细胞内钙离子(Ca~(2+))转运的影响,为胎儿心肌保护奠定实验基础。方法取胎龄14～18 d SD(Sprague-Dawley)大鼠胎鼠的心肌细胞置于含5%CO2,3%O2和92%N2的三气培养箱,在37℃下培养24 h。实验分6组进行干预:对照组(1组),磷酸肌酸钠10 μM(2组),HIF-1激动剂(DMOG)100 μM(3 组),磷酸肌酸钠 10 μM+DMOG 100 μM(4 组),HIF-1 抑制剂(Acriflavine)10μM(5组),磷酸肌酸钠10μM+Acriflavine 10μM(6组),共同作用24 h后,分别进行实时荧光定量PCR(real time-PCR)和免疫印迹分析(Western-blot)检测胎鼠心肌细胞HIF-1α、L型钙离子通道(L-type calcium channel,LCa)、T 型钙离子通道(T-type calcium channel,TCa)、钠钙交换蛋白(Na+/Ca~(2+) exchanger,NCX)、兰尼碱(Ryanodine)受体和肌质网 Ca~(2+)-ATP 酶(Sarco/endoplasmic reticulum Ca~(2+)-ATPase 2a,SERCA2a)mRNA 转录及蛋白表达水平。在激光共聚焦显微镜下观察心肌细胞内钙离子(Ca~(2+))浓度的变化。结果Real-time PCR结果显示:药物干预和磷酸肌酸钠在HIF-1α、TCa、NCX、Rynaodine受体mRNA转录水平上有交互作用,磷酸肌酸钠抑制药物干预的作用。没有磷酸肌酸钠作用的组间比较:3组的HIF-1α、TCa、和NCX、Rynaodine受体的mRNA转录水平明显高于5组(P0.05,n=5)。磷酸肌酸钠作用的组间比较:4组的HIF-1α、TCa、和NCX、Rynaodine受体的mRNA转录水平明显高于6组(P0.05,n=5)。药物干预和磷酸肌酸钠在LCa和SERCA2a的mRNA转录水平上无交互作用,但SERCA2a的mRNA转录水平在5组、6组显著大于1组、2组、3组和4组(P0.05,n=5)。Westernblot结果显示:药物干预和磷酸肌酸钠在各基因的蛋白表达上无交互作用,1组、2组的LCa的蛋白表达较3组、4组、5组和6组显著升高(P0.05,n=5),SERCA2a的蛋白表达2组3组(P0.05)。钙瞬变荧光量测定结果显示药物干预和磷酸肌酸钠有交互作用,磷酸肌酸钠抑制药物干预产生的钙瞬变(P0.05,n=10)。结论低氧条件下HIF-1参与胎鼠心肌细胞内Ca~(2+)转运的调节。过度激活HIF-1 增强 TCa、NCX 和 Rynaodine 受体 mRNA 转录水平,降低 SERCA2a mRNA转录水平,同时下调LCa的蛋白表达,从而增加细胞内的Ca~(2+)超载。给予磷酸肌酸钠,抑制了 HIF-1及其调节的Ca~(2+)通路蛋白的mRNA水平,从而减轻细胞内的Ca~(2+)超载。由此推断,抑制HIF-1活性、给予能量底物可能对胎儿心肌有保护作用。
【图文】：

电泳条,逆转录反应,逆转录,总体积

图３－１邋ＲＮＡ电泳条带图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ｅｌｅｃｔｒｏｐｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｂａｎｄｉｎｇ邋４）逆转录反应逡逑①取４ｕｌ邋ＲＮＡ模板做逆转录反表３－２Ｔａｂｌｅ３－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｖｅｒｓｅ逦ＲＮａｓｅ邋Ｆｒｅｅ邋ｄｄＨ２0５邋ｘ邋ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ？邋Ｂｕｆｆｅｒ（ｆｏｒ邋ｒｅａｌ逦ｔｉｍＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ？邋ＲＴ邋Ｅｎｚｙｍｅ邋Ｍｉｘ逦ＩＯｌｉｇｏ邋ｄＴ邋Ｐｒｉｍｅｒ（５０邋｜ｉＭ）Ｒａｎｄｏｍ邋６邋ｍｅｒｓ（１００邋｜ｉＭ）ＲＮＡ总体积②反应条件：３７°Ｃ邋６０ｍｉｎ，然

原代培养,心肌细胞,细胞生长,磷酸肌酸钠

在含５％邋Ｃ0２，邋３％邋0２和９２％邋Ｎ２混合气体的低氧培养箱内３７°Ｃ培养２４邋ｈ逡逑后，于４０倍显微镜下可见心肌细胞贴壁生长，初为圆形，后变为梭形，单个细逡逑胞开始搏动。细胞逐渐在培养板铺展，伸出伪足，相互接触交织成网（见图４－１）。逡逑ｆ逦％逦？逡逑．逦：，逡逑ｋＶ逦／逦．？逦－逡逑．逡逑？‘逡逑图４－１心肌细胞原代培养（４0ｘ）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４－１邋Ｔｈｅ邋ｐｒｉｍａｒｙ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ（４0ｘ）逡逑４．２与药物共同作用后的细胞生长情况逡逑分组加入药物后培养２４ｈ，４０倍显微镜下观察细胞生长情况。在ＤＭＯＧ作逡逑用下，细胞生长活跃，收缩有力；Ａｃｒｉｆｌａｖｉｎｅ作用下，细胞生长缓慢，且收缩逡逑减弱；增加底物磷酸肌酸钠，细胞生长活跃，收缩较无增加底物有力（见图４－２）。逡逑＇邋；５邋＾邋；＊逡逑？邋一邋Ｈ邋ｒ」逡逑＼邋＊邋％邋４邋？？邋，邋？？邋＼邋？逡逑＾逦？逦＞邋ｊｍ逦一逡逑空白对照组（１组）逦磷酸肌酸钠１０邋ｇＭ邋（２组）逡逑１６逡逑
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R654.2

【参考文献】