循环牵张应力调节雪旺细胞神经营养因子和成髓鞘基因表达的实验研究

发布时间：2019-12-03 16:19

【摘要】：【目的】本研究旨在应用ElectroForce3200力学试验仪搭载的BioDynamic生物反应舱,结合使用Sylgard184硅橡胶薄膜载体,对体外培养的雪旺细胞(Schwann Cells,SCs)施加不同频率参数单轴向循环牵张应力(Cyclic Tensile Strain,CTS)。观察SCs的形态、分布以及增殖活性的变化并检测SCs神经营养因子和成髓鞘基因的表达和细胞骨架肌动蛋白的变化,探究CTS加载于体外培养SCs后的神经修复相关生物学行为,选择适宜的CTS刺激频率参数,并为CTS结合SCs应用于脊髓损伤临床治疗提供新的方向和理论基础。【方法】本研究将SCs进行体外分离培养和传代,将SCs尝试接种于拥有良好生物相容性和力学性能的Sylgard184基底膜上进行体外培养,配合使用ElectroForce3200力学测试仪,以5%形变量对SCs施以时长为6小时的CTS,并依照加载频率分为对照组(0Hz)、0.25Hz和0.5Hz,共3组。通过相差显微镜观察力学加载后细胞形态、分布情况;使用CCK-8法观察加载后SCs的增殖情况;通过实时定量PCR(Quantitative Real-time-PCR)和免疫印迹法(Western blot)检测神经营养因子和成髓鞘基因在力学加载后表达的变化;使用免疫荧光染色(Immunofluorescent staining)检查力学加载后细胞骨架肌动蛋白的变化及其与成髓鞘基因表达改变的联系,获取实验数据并进行统计学分析。【结果】本研究成功构建体外培养SCs的CTS加载模型,精确地对体外培养的SCs施加不同频率的CTS刺激。实验结果表明:对照组(0Hz)SCs形态及分布无明显改变,0.25Hz组SCs形态饱满,细胞排列方向呈极性分布(与牵拉方向一致),0.5Hz组的SCs出现局部脱落,散在分布;通过qPCR和Western blot验证和CCK-8检测增殖情况,结果表明培养0.25Hz组SCs至第7天时,其增殖活性高于其余两组(P0.05),且0.25Hz组CTS较其余两组显著促进SCs神经营养因子(BDNF、NGF、NT-3)的合成与分泌,并上调成髓鞘基因Krox-20和MAG的表达(P0.05);同时,免疫荧光染色法显示经过CTS刺激后Krox-20基因表达增强,并可观察到F-actin向SCs核周聚集趋势。【结论】SCs促进神经修复的相关生物学功能受到所加载CTS的影响和调控。本研究证实SCs的形态、分布以及增殖活性均可受到所加载CTS的影响:适宜频率的CTS刺激可使SCs胞质更加充盈,细胞排列具有方向性(与牵拉方向一致),过高频率的CTS刺激不利于SCs在基底膜的附着;适宜频率的CTS作用于SCs可以促进细胞增殖;上调多种神经营养因子(BDNF、NGF、NT-3)的合成与分泌并上调重要成髓鞘基因Krox-20和MAG的表达。SCs经CTS刺激后,成髓鞘基因Krox-20表达的改变可能是由细胞骨架F-actin所介导,但其具体机制仍需进一步探索。
【图文】：

对照组

天津医科大学硕士学位论文循环牵张应力对雪旺细胞形态和增殖的影响状排列。将第三代的 SCs 使用免疫化学 S-100 染色鉴定，在光镜下对细胞形态进行观察：体积相对较小，，外形为长梭形的双极或多极形态，胞核较亮，突起较暗，染色呈绿色即 SCs。成纤维细胞通常呈现不规则形态且并未被染色。细胞S-100 染色后显示纯度良好，为后续提供了研究基础（图 3）。1.2.2 循环牵张应力对雪旺细胞形态的影响各频率刺激下 SCs 形态在镜下观察形态呈现较明显差异。对照组（0Hz）：SCs 无特殊改变且无明显极性分布；0.25Hz 组：SCs 形态较饱满，排列方向呈现一定的规律性分布；0.5Hz 组：部分区域无 SCs 附着，依然附着的 SCs 分散生长且排列无规律性（图 4）。

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士学位论文循环牵张应力对雪旺细胞形态和应力对雪旺细增殖的影响加形变率 5%的 CTS 作用 6 小时，频率分为对照组（0完成后 3 天，5 天，7 天应用 CCK-8 检测 SCs 增殖活之后的第 7 天，0.25Hz 组与 0Hz 组，0.25Hz 与 0.5Hz意义（P＜0.05），提示 0.25Hz 组 SCs 在第 7 天的增殖第 3 天和第 5 天各组 OD 值之间则无明显统计学差异被认为是刺激 SCs 增殖的适宜频率，为后续实验提供
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R651.2

【参考文献】