转人AT-Ⅲ的骨髓间充质干细胞抗异种移植凝血紊乱的研究

发布时间：2020-01-19 10:25

【摘要】：背景肝脏移植手术是肝脏疾病患者病变发展至终末期,无法用传统手术切除病灶,药物治疗不能控制病情发展时的首选治疗方法。由于新型免疫抑制剂的广泛应用,发生在同种异基因的肝移植术后的排斥反应已经基本得到解决,受体的存活时间已经得到显著的改善。但是当今肝移植治疗所面临的最大障碍是供体短缺的问题。众所周知,我国是“肝病大国”,携带乙型肝炎的患者多达9300万之多,每年因终末期肝脏疾病死亡的患者有30万之多,多数患者可以通过肝移植进行治疗,延长寿命,但是多数患者都面临“无肝可用”的问题,全国每年实施的肝移植手术不足4000例。虽然近些年来我们大力发展无偿器官捐赠,但由于全面禁止死囚器官来源的规定出台后,供体短缺问题依然是阻碍肝移植最大的瓶颈。异种肝移植可以为患者争取更多时间等待供肝,甚至有可能完全取代人类肝脏,为广大肝病患者带来希望,为解决困扰世界的供肝短缺问题提供了彻底解决的方法。但异种移植目前还存在免疫排斥和凝血功能障碍等难题,距离临床应用尚有不小的距离。随着α-1,3-半乳糖转移酶(α-1,3-galactosyltransferase,α-1,3GT)基因敲除猪(GTKO)的问世,异种超急性排斥反应(hyperacute rejection,HAR)已得到基本控制,但随后发生的急性体液排斥反应(Acute humoral xenograft rejection,AHXR)仍是造成异种移植物失活和受体死亡的主要原因。AHXR是一个多因素多途径的免疫反应过程,其主要的病理特征是血栓性微血管病或消耗性凝血病如弥漫性血管内凝血(Disseminated Intravascular Coagulation,DIC)。目前研究表明供受体的凝血-抗凝血系统不相容所引发的受体凝血功能紊乱是造成异种移植凝血功能障碍发生的重要原因。抗凝血酶-3(Antithrombin-III,AT-III)在猪与灵长类动物之间由于存在种属差异,不能在人体内发挥有效抗凝作用,致使移植器官血管内广泛产生血栓,最终导致移植失败。AT-III是血浆中最重要的抗凝物,其由肝脏及血管内皮细胞产生,在肝素的协同作用下与FXa和凝血酶结合发挥抗凝血作用。本研究拟以猪骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenehymal stem cells,MSCs)为载体,利用慢病毒感染的方法,使猪MSCs表达人AT-III,并利用体外异种移植凝血模型对其抗凝效果进行检测,希望为解决异种肝移植术后受体凝血功能紊乱提供新方案和新思路。目的本实验利用慢病毒感染技术,将人抗凝血酶III(AT-III)的基因转入GTKO猪源性的骨髓间充质干细胞中,使其表达并分泌人源性抗凝血酶III,从而减少异种移植中因供受体间凝血调节因子不相容引起的凝血紊乱。方法1.提取GTKO小型猪的髂骨骨髓,应用反复贴壁法,将提取细胞反复贴壁传代,到3-6代细胞进行流式细胞术检测其表面标记物,并对GTKO猪源性骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化,通过油红O、茜素红和Gomori法染色,对间充质干细胞的分化功能进行检测。2.构建SV40T慢病毒载体,并对得到的GTKO猪源性的骨髓间充质干细胞进行感染,达到间充质干细胞永生化的目的,然后应用RT-PCR技术对感染后的间充干细胞SV40T的表达情况进行检测。3.构建人AT-III基因的慢病毒载体,感染永生化的骨髓间充质干细胞,并用空质粒感染间充质干细胞作为对照组,应用免疫荧光技术、RT-PCR技术和Western blot技术,对转染后间充质干细胞人AT-III的m RNA和蛋白表达情况进行检测。4.将人血清、猪内皮细胞和GTKO小型猪的骨髓间充质干细胞进行共培养,构建异种移植凝血障碍体外模型,转染空质粒MSC作为空转染组、转染h AT-ⅢMSC为转染组,加入重组h AT-Ⅲ蛋白为重组h AT-Ⅲ组和经鼠抗h AT-Ⅲ阻断性抗体处理的转染h AT-ⅢMSC为抗h AT-Ⅲ组,应用ELISA技术检测共培养体系中凝血酶-抗凝血酶复合物的含量,应用复钙实验检测各实验组的凝集时间。结果1.反复离心、贴壁,不断纯化间充质干细胞,在第3代得到GTKO猪源性骨髓间充质干细胞,应用流式细胞技术对其表面标记物进行检测,检测结果提示造血细胞的表面标记物CD34、CD45低表达,高表达干细胞表面标记物CD29、CD90、CD105。进行成脂、成骨定向分化诱导,并对诱导的细胞分别进行特异性染色,油红O染色看到细胞胞质内红染的脂滴,Gomori法染色可以看到胞质内钙结节的黑色颗粒,茜素红染色可以看到红染的钙结节。提示骨髓间充质干细胞分化能力良好,具有干细胞特性。2.构建SV40T的慢病毒载体,测得病毒滴度为5×108TU/ml,对得到的骨髓间充质干细胞进行感染,感染后应用RT-PCR测定SV40T的m RNA表达,实验结果提示成功导入SV40T抗原基因。3.通过慢病毒感染人AT-III基因后进行免疫荧光染色、RT-PCR和Western bolt对转入的人AT-III进行检测,结果提示成功导入目的基因。4.AT-III AT-III组凝集时间延长,出现纤维蛋白丝的时间较对照组长;应用凝血结合实验ELISA法检测体系中凝血酶-抗凝血酶复合物的含量,结果提示转染组中凝血酶-抗凝血酶含量较对照组高,转染组中分泌的人AT-III可以有效结合凝血酶,抑制其发挥促凝血的作用。结论成功提取GTKO小型猪源性的骨髓间充质干细胞,并使其永生化建立细胞系,成功转入人AT-III基因,并且表达良好,经过转入人AT-III基因的骨髓间充质干细胞在异种移植凝血障碍体外模型中可以有效地抑制凝血紊乱的发生。
【图文】：

骨髓间充质干细胞,猪源,间充质干细胞

图 1 GTKO 猪源性骨髓间充质干细胞的鉴定。A:光镜下骨髓间充质干细胞的形态（×100）；B:骨髓间充质干细胞表面标记物的流式图；C:成脂诱导油红染色（×200）；成骨诱导 Gomori法 ALP 染色（×200）；成骨诱导茜素红 ALP 染色。4 讨论间充质干细胞具有低免疫原性，多向分化性。国内外报道多例间充质干细胞用于细胞治疗，例如王建伟等[106]在豚鼠-大鼠的原位异种移植手术前，将间充质干细胞输入受体体内，可以明显干预异种移植的排斥反应，可以使移植物存活更长时间。本实验采用大动物猪源性的骨髓间充质干细胞，取自 GTKO 小型猪的髂骨，并应用反复贴壁法来获得骨髓间充质干细胞。通过比较，骨髓穿刺法提取骨髓虽然获得的间充质干细胞较少，但保证实验动物的存活的情况下可以进行反复的提取，并可以将实验动物用于后续的大动物动物实验中，避免了资金的浪费。

荧光激发,感染后,荧光显微镜,慢病毒

图 2 感染 SV40T 基因后 293T 细胞 SV40T 的表达微镜下观察 SV40T 感染后 293T 细胞后的荧光激发情况，，图野均为特异性荧光，而 7 号空中特异性荧光较少。如图 3T 转染后 293T 细胞病毒滴度 A：1 号孔慢病毒液 10×10-3mL B毒液 10×10-8mL（IF×100）
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R657.3

【参考文献】