慢病毒介导VEGF165感染hADSCs与HUVEC共培养构建工程脂肪修复大鼠软组织缺损的实验研究

发布时间：2020-02-05 14:15

【摘要】：[目的]：1.探讨携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的慢病毒载体感染人脂肪间充质干细胞(hADSCs)的最佳条件及其对hADSCs成脂分化能力的影响；2.hADSCs与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)建立共培养体系,与丝素蛋白支架联合构建组织工程脂肪的可行性；3.慢病毒介导VEGF165感染hADSCs与HUVEC共培养构建的脂肪组织工程修复大鼠后肢软组织缺损。[方法]：1.从人体正常脂肪组织中提取出脂肪问充质干细胞,体外培养并扩增；行成脂及成骨诱导鉴定脂肪间充质干细胞的多向分化特性,流式细胞仪检测细胞表面分子CD3、CD44、CD45、CD90;在不同的感染复数(MOI)条件下,对hADSCs感染8小时后观察感染效果；流式细胞仪检测感染效率；MTT法检测感染对hADSCs的增殖能力的影响；对感染后的hADSCs 成脂诱导 14d,行油红0染色后,应用Image-Pro Plus图像分析软件比较hADSCs的成脂能力；2.HUVEC的扩增与表面分子CD31、CD34的测定；hADSCs与HUVEC增殖曲线的测定,观察两种细胞按照不同比例共培养时生长情况；将共培养细胞种植于丝素蛋白支架后行电镜扫描观察细胞在支架上的形态；成脂诱导14天后,油红O染色及RT-PCR鉴定共培养组与单纯hADSCs组成脂情况。3.体内实验：选取Wistar大鼠18只,制成后肢软组织缺损模型。实验设计分为三组,Ⅰ组：经VEGF165基因转染的hADSCs与HUVEC构成的共培养体系,Ⅱ组：单纯经VEGF165基因转染的hADSCs,Ⅲ组：为空白对照。分别将两组细胞与多孔丝素蛋白支架联合后,种植于大鼠模型的软组织缺损处,于4w及8w取材,观察构建物在体内的生长情况,并比较湿重,电镜下观察细胞的生长情况；行HE染色观察构建的工程脂肪成脂及血管化情况,油红O染色观察成脂情况。[结果]：1.脂肪组织中成功分离出脂肪间充质干细胞,流式细胞仪检测CD44及CD90阳性,CD34及CD45阴性,多向分化能力。以MOI值1、10、25、50、75、100、150携带EGFP的慢病毒感染hADSCs时,其感染效率依次为0.24%、13.48%、40.33%、89.27%、94.52%、98.49%和99.11%。以MOI值50感染iADSCs,比较感染前后细胞的增殖与成脂能力,差异无统计学意义(P0.05)；2.流式细胞仪测定HUVEC表面分子CD31 (+), CD34马阳性；MTT结果显示HUVEC增殖速度快于1ADSCs,以 HUVEC:hADSCs为1：4比例共同培养3天后,细胞融合时两者比例约为1：1；将共培养细胞接种于丝素蛋白支架,成脂诱导14天后,通过RT-PCR可成功测定出PPARγ2基因的表达,油红O染色表明成脂诱导后,两组均能诱导出大量的脂肪细胞；3.饲养4w及8w后,大体标本结果显示均能修补软组织缺损,比较两组构建物的湿重：VEGF 165-hADSCs-HUVEC共培养组 VEGF165-hADSCs组,冰冻切片后行油红O染色均可见红染的脂滴,电镜下共培养细胞状态明显优于较单纯hADSCs组；HE染色两组均有不同程度的血管化,但VEGF 165-hADSCs-HUVEC共培养组血管数目明显多于单纯VEGF165-hADSCs组。[结论]：1.慢病毒感染ADSCs的最佳MOI值为50,感染后对hADSCs增殖,成脂能力无明显影响；2. hADSCs可与HUVEC共同培养,以1：4比例构成共培养组与丝素蛋白联合,可在丝素蛋白支架上成功构建出工程脂肪。3.以慢病毒介导VEGF165感染的hADSCs与HUVEC共培养体系为种子细胞,有孔丝素蛋白为支架材料,所构建的组织工程脂肪可有效修复大鼠软组织缺损。
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R622

【参考文献】