microRNA在心脏手术相关性急性肾损伤的差异表达和临床研究

发布时间：2020-03-18 07:27

【摘要】：背景急性肾损伤(AKI)是住院患者常见及严重的并发症,增加了住院患者的死亡率。体外循环的心脏手术是仅次于脓毒症之后导致AKI的第二类常见原因。心脏手术相关的急性肾损伤(CSA-AKI)的病理生理学是复杂的,有多个因素参与,其包括的损伤途径有:缺血再灌注损伤,外源性和内源性毒素,炎症反应,氧化应激和血流动力学因素。目前认为体外循环(CPB)是心脏术后发生AKI的主要致病因素。心脏术前具有高危因素的患者,比如高龄,糖尿病,心衰以及需要长时间CPB的心脏手术都增加了术后AKI的发生风险,大约增加了30%~40%。目前在临床上,术前具有并发症的患者以及需要复杂心脏外科治疗的患者日益增多,那么,CSAAKI的发生率就会有进一步增高的趋势。所以,CSA-AKI是一个亟待需要阐明的临床综合征。CSA-AKI患者是理想的AKI研究人群,因为损害的时间已知。而目前CSA-AKI的发病机理还不明确,代表肾脏损伤的指标也不能及时诊断AKI的发生。微小RNA(miRNA,miR),是一类非编码小分子RNA,长度大概20到24个核苷酸,通过与靶向信使RNA(m RNA)的3'-非编码区结合从而抑制靶向蛋白的翻译,实现在转录后水平上对基因的表达进行负调控。近几年miRNA在肾脏疾病领域的研究是一个热点问题。目前对动物模型和一些类型AKI的研究,比如缺血再灌注损伤的AKI,肾移植术后的AKI,积累的证据表明,多种miRNA可能参与了AKI的发病机制,显示了其潜在的临床价值,提供了研究CSA-AKI分子机制的新思路;被分泌到循环或尿液中的miRNA可以作为具有高度敏感性和特异性的生物标志物来研究CSA-AKI的发生、发展和转归。目的筛查体外循环心脏外科术后患者的血清,分析在CSA-AKI与非CSA-AKI患者之间差异表达的miRNA,初步探讨参与CSA-AKI发生过程的miRNA,并选取CSAAKI相关的miRNA进行临床验证。方法通过miRNA芯片技术来筛查体外循环心脏外科术后患者的血清,筛查CSA-AKI患者与非CSA-AKI患者之间miRNA的表达差异。本研究通过医院伦理委员会同意,并取得患者知情同意书。选择在安徽医科大学第一附属医院心脏外科行体外循环停跳下瓣膜手术或者瓣膜手术同期行冠状动脉旁路移植手术的成人患者,术前没有慢性合并症,术后没有发生肾脏以外的器官损伤。CSA-AKI诊断根据2012年肾脏疾病改善全球预后(KDIGO)标准,即患者的血清肌酐在心脏术后48小时内上升大于0.3mg/dl(26.5mmol/L)或者在心脏术后7天内血清肌酐较术前基础值上升了1.5倍以上。所有患者行统一常规的术前检查,术中麻醉及手术操作,术后重症监护及常规检查。所有患者临床无特殊情况的用药。采集患者术前(年龄、性别、体重、身高、纽约心功能分级),术中(体外循环时间,主动脉阻断时间,手术时间),术后(机械通气时间,ICU停留时间,住院时间)的临床数据。在患者进入监护室24小时左右,抽取桡动脉血液5ml,静置、离心、分装后冻存于-80°?冰箱,避免反复冻融,收集完成后统一送样进行miRNA的芯片筛查。使用edge R软件对分组间进行miRNA的差异分析。差异miRNA的筛选标准为表达量变化2倍以上并且P值小于0.05。通过miRNA芯片技术筛查出来CSA-AKI相关的miRNA,采用荧光定量PCR技术,来进一步的做临床验证。选取在患者进入手术全身麻醉后、外科正中开胸前(1),手术完成入监护室后1小时(2)、3小时(3)、6小时(4)、12小时(5)及24小时(6),在上述6个时间点抽取桡动脉血液5ml,静置、离心、分装后冻存于-80°冰箱,等待统一送样进行检测。测定的指标包括某种CSA-AKI相关的miRNA(Real-time PCR),血清肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)及中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白(NGAL)(酶联免疫法),血清白介素-6(IL-6)和白介素-10(IL-10)(化学发光法)。结果miRNA芯片技术共筛查共了7位患者的血清,其中心脏术后非AKI组(NONAKI)3位患者,CSA-AKI组(AKI)为4位患者,术后的AKI都为一过性,出院时肾功能均已恢复至术前基础值水平。两组患者术前、术中和术后临床资料大致相同。分别经过提取血清样本的质检合格,小RNA文库的质检合格,数据过滤的质检合格后进行数据分析处理,CSA-AKI组和心脏术后的正常对照组比较共有38个miRNA的表达差异,其中表达上调的miRNA有24个,表达下调的miRNA有14个。选取CSA-AKI相关的hsa-miRNA-494-3p在AKI组(n=10)心脏术后1小时即上升达到峰值,在术后3小时和术后6小时仍与NON-AKI组(n=8)有统计学差异(P0.05)。AKI组的NGAL在术后3小时与NON-AKI组有统计学差异(P0.05)。血清IL-6在心脏术后24小时内各个时间点上,以及术后48小时、72小时,两组间均无统计学差异(P0.05)。IL-10,MCP-1和TNF-a在心脏术后24时内各个时间点上,两组间均无统计学差异(P0.05)。C-反应蛋白(CRP)水平在心脏术后第一天、第二天、第三天持续上升,并且CRP水平在AKI组较NON-AKI组要高,但是,CRP水平在两组间的各个时间点上也无统计学差异(P0.05)。白细胞计数(WBC)在两组都表现为心脏术后持续升高,48小时左右达到高峰后下降,但是,在两组间各个时间点上并无统计学差异(P0.05)。中性粒细胞百分比(N(%))在两组都表现为心脏术后持续升高,48小时左右达到高峰后缓慢下降,并且,N(%)在两组间各个时间点上均无统计学差异(P0.05)。白蛋白(ALB),总胆红素(TBIL)和谷丙转氨酶(ALT)在两组间术后七天内的各个时间点上均无统计学差异(P0.05)。结论通过高通量miRNA的芯片检测技术,筛查了在CSA-AKI患者与非CSA-AKI患者之间差异表达的miRNA,共有38个已知的人类miRNA,其中表达上调的miRNA基因有24个,表达下调的miRNA基因有14个,miRNA的差异表达可能揭示了CSA-AKI的发病机制。在筛查的38个CSA-AKI相关的miRNA中,验证了hsa-miR-494-3p可以作为CSA-AKI患者早期诊断的分子生物学标记物,hsa-miR-494-3p可能参与了CSA-AKI发生过程的早期阶段,并且也可能预示了CSA-AKI的预后。
【图文】：

序列,实验流程,信息分析,基因差异

图 1-1 实验流程图Fig1-1 Flow chart信息分析息分析部分主要分成三个模块：首先，对每个样品的原始测序数 RNA 的 tag 序列；其次，对 tag 进行注释，鉴定样品中的小 R，鉴定 miRNA；最后，得到 miRNA 表达谱，对 miRNA 基因差异分以及靶基因的富集分析。信息分析流程见图 1-2 所示。数据处理

血清,患者,安徽医科大学,博士学位论文

安徽医科大学博士学位论文术期的变化见图 2-3。心脏术后第 1 小时 AKI 组的血清 miRNA-494-3p 值是 33.10±35.73，NON-AKI 组是 3.37±4.32，两组间有显著的统计学差异（P=0.0068）；术后 3 小时 AKI 组的血清 miRNA-494-3p 值是 22.11±32.26，NON-AKI 组是 2.40±2.67，两组间有统计学差异（P=0.0136）；术后 6 小时的血清 miRNA-494-3p 值在AKI 组是 15.29 ± 12.66 ，， NON-AKI 组是 2,89 ± 2.17 ，两组间有统计学差异（P=0.0155）。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R654.2;R692.5

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