骨髓间充质干细胞通过Treg细胞及IL-10延长大鼠异位移植心脏存活

发布时间：2020-04-01 07:55

【摘要】：背景与目的:心力衰竭晚期,通常会选择心脏移植手术来进行治疗,可有效缓解病情,但是在心脏移植手术以后,会产生免疫排斥反应,严重影响到移植手术的效果。寻找新的抑制移植排斥反应的方法是当今医学面临的重要问题之一,本课题利用异基因大鼠异位心脏移植模型,研究骨髓间充质干细胞对移植心脏存活的影响及其对心脏移植大鼠免疫功能的调节作用。方法:1.大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养:取10只Wistar大鼠在无菌条件下取其股骨、下肢胫骨骨髓,用含体积分数为15%胎牛血清的DMEM培养液对骨髓腔进行反复冲洗,收集骨髓冲洗液并反复抽吸吹打获得单细胞悬液,用注射器回收细胞悬液于10ml离心管中,离心后去上清,将沉淀通过含15%胎牛血清的DMEM培养液重新悬浮,然后添加密度为1.085g/ml的Ficoll淋巴细胞分离液,离心分层,取出乳白色单个核细胞层,由包含15%胎牛血清DMEM培养液进行重新悬浮,在25cm~2塑料培养瓶容器内进行接种,放置在37℃环境内,含量为5%CO_2饱和湿度恒温培养箱中培养,约2天后更换培养液,以后每周换液2次,借助倒置显微镜设备进行观察,当细胞出现80%融合,此时开始传代培养,获得第4-6代细胞备用。2.MSCs的鉴定:根据细胞自我更新增殖能力、形态特征及细胞表面标志对MSCs进行鉴定。倒置显微镜下观察细胞增殖和形态;细胞免疫化学染色及流式细胞仪检测MSCs表面CD29、CD90、CD34和CD45表达。3.MSCs移植:在心脏移植术前一周对实验组受者Wistar大鼠通过尾静脉注射MSCs,每只大鼠注射2×10~5个MSCs(0.5m L),隔天注射一次,心脏移植当天和移植后3天继续注射MSCs。对照组注射等剂量氯化钠注射液。4.制备心脏异位移植大鼠模型:Lewis大鼠20只作为供体,Wistar大鼠和20只作为受体,采用套管法建立大鼠颈部心脏移植模型。手术分离取出Lewis大鼠的心脏,将其升主动脉和肺动脉根部分离,用50U/ml的O-4℃肝素生理盐水对管腔冲洗,通过脑棉包裹心脏备用。分离Wistar大鼠颈外静脉和颈总动脉并于远端切断、结扎并用血管穿刺管外鞘管进行固定。将供心主动脉与受体右颈总动脉吻合固定,将供心肺动脉与受体右颈外静脉吻合固定,移植心脏位于右侧颈部皮下,每日观察大鼠心跳、精神状态。手术48小时之后,如果移植心脏停跳,手术不成功。如果移植心脏跳动48h以上,即可视为模型建立成功。5.细胞因子IL-2、IL-10和T细胞亚群检测:心脏移植术后7d,采用ELISA法检测MSCs注射组和对照组大鼠血清白细胞介素2、白细胞介素10表达水平,流式细胞术检测大鼠血液中T细胞亚群在淋巴细胞中所占比例。6.移植心脏存活时间及病理组织学观察:术后7d实验组和对照组各取一半大鼠,处死后对移植心脏进行病理学观察;另一半大鼠继续观察移植心脏存活天数,每日观察大鼠精神状态,按时触诊移植心脏,观察移植心脏搏动幅度、节律及速度。结果:1.MSCs形态、增殖和细胞表面标志检测:骨髓单个核细胞培养1-3d细胞逐渐贴壁、由圆形向多角形过渡,传2-3代后细胞形态呈现典型的扁平、贴壁、长索状或多角形;细胞增殖明显,每3天传代一次,随传代次数增加,细胞形态均一度增强;收集传4-6代细胞,进行细胞表面标志检测。结果显示:MSCs CD29、CD90表达阳性率分别为98.42%、97.73%,而CD34和CD45表达阳性率分别为1.35%、2.52%,符合骨髓MSCs的特征。2.MSCs对移植心脏存活时间的影响:对两组的术后移植心脏存活时间进行统计和比较,结果显示:MSCs注射组心脏存活时间为(14.25±2.15)d,显著长于对照组(7.15±1.35)d,P0.05。3.MSCs对心脏移植大鼠IL-2、IL-10和T细胞亚群的影响:术后7d,ELISA法检测分别心脏+MSC移植组和心脏移植组大鼠的血清白介素2、白介素10表达水平,两组白介素2水平分别是248.15±25.23 pg/ml、230.25±20.35 pg/ml,二者差异无统计学意义,P0.05。但心脏+MSC移植组的血清白介素10为160.23±18.75 pg/ml,显著高于心脏移植组(80.25±12.26 pg/ml),P0.05。术后7d,对两组大鼠血中T细胞亚群在淋巴细胞中所占比例进行检测和比较,发现心脏+MSC移植组的CD4~+、CD4~+/CD8~+、CD4~+CD25~(high)、CD4~+CD25~(high)Foxp3~+所占比例均显著高于心脏移植组,P0.05。4.移植心脏的组织病理学观察:术后7d获得移植心脏组织标本进行病理学观察发现,未注射MSC的心脏移植组的心肌组织有淋巴细胞及单核细胞大量浸润现象,末梢小血管内血栓形成等超急性排斥反应的特征病变,存在明显的心肌间质水肿、出血,存在不同程度的心肌黏液性坏死和心肌细胞变性坏死。而心脏+MSC移植组的心肌组织中存在少量的淋巴细胞浸润,出现灶性心肌细胞损害,心肌间质可观察到轻微出血和水肿,较之心脏移植组炎性反应程度较轻。结论:对接受心脏移植的大鼠实施骨髓间充质干细胞治疗可延长术后心脏移植物的存活时间。MSCs有可能通过调节大鼠的免疫功能,对器官移植排斥反应发挥一定抑制作用。
【图文】：

颈外静脉,颈总动脉,受体,大鼠

材料与方法后在分支处切断、结扎。然后在其颈外静脉近心端于远端切断、结扎，在其末尾处利用牵引线在 16G脉，再通过显微镊夹翻转血管，使其位于 16G 血管进行固定，可通过 6-0 丝线环进行。其次再进行颈总右边胸锁乳突肌进行切断，并结扎，再根据以上方刺管外鞘管。

离体,供体

图 2.2 供体大鼠心脏离体后修理鼠右边颈部位置放置通过包裹在脑棉里的，确保供心放置位置与切口相符，然后通过鼠 2 根血管进行观察，，确保其通畅。然后再在其中插进受体大鼠的颈总动脉套管，结扎。并采用相同方法，让供体肺动脉相连于首先放开静脉，之后再放开动脉，然后在渐转换成复跳，再经过 5-10min 之后，即可进行相应调整，避免其血管弯曲受到压迫合。大鼠在 15-30min 后就能行动，手术后不(70±15)min，而在手术过程中，冷缺血时
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R654.2

【参考文献】