创伤性颅脑损伤诱导MANF蛋白的表达及其对脑损伤的保护作用

发布时间：2020-04-08 01:15

【摘要】：创伤性颅脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)是临床常见的危重急症,具有较高的致死和致残率。而继发性脑损伤属于可逆性病理过程,是临床救治的主要方面,其中过度的神经炎症反应一直认为是继发性脑损害的重要病理机制。MANF(Mesencephalic Astrocyte-derived Neurotrophic Factor)作为一种新型神经营养因子,对内质网应激敏感。已有的研究表明,其在脑缺血模型中具有明显的脑保护作用,并且可在小胶质细胞中诱导表达,可能参与了脑缺血后神经炎症反应的调节作用。但目前为止,仍未见MANF在TBI后继发性颅脑损伤中的作用及机制报道。我们希望据此课题研究,不仅为TBI后继发性脑损伤的病理学新机制提供理论依据,同时也对临床以此为靶点治疗重型TBI的新技术提供实验基础,从而显著降低该病的致残率及死亡率,具有极大的经济与社会价值。第一部分TBI诱导大鼠脑组织内源性MANF的表达目的创建大鼠重型TBI模型并评估其特点和重复性;观察TBI后脑组织中内源性MANF蛋白的表达,并进一步确定表达MANF的细胞类型及和分布特征。方法将48只SD雄性成年大鼠随机分为对照组(Sham组,n=24)、颅脑创伤组(TBI组,n=24)。TBI组采用改良的Feeney′s自由落体撞击法(50g×20cm)构建创伤模型。Sham组仅磨除颅骨、不予撞击操作。造模后24小时,两组均给予行为学、头颅MRI、HE染色及免疫荧光等检测方法予以评估。在证实模型组病理损伤有效且稳定后,选取挫伤灶周围脑组织行免疫组化、逆转录PCR及免疫印迹法明确创伤后MANF的表达改变;同时应用免疫荧光及双标的方法了解脑组织中MANF蛋白表达的空间和细胞差异。结果创伤后24小时,TBI组大鼠的Garcia评分明显下降、头颅MRI之T2 WI图像可见弥漫高信号脑水肿改变、HE切片可见明显神经细胞及纤维的损伤、免疫荧光染色提示创伤后小胶质细胞的明显激活,且每个动物模型间的病理损伤程度均相似。逆转录PCR、免疫印迹及免疫组化均证实TBI后挫伤灶周围MANF的表达水平显著增加(P0.01)。免疫荧光检测提示其分布较为广泛,在同侧大脑皮层及海马组织中均较明显;另外MANF蛋白的表达在神经元细胞、微血管内皮细胞及小胶质细胞中均有体现,且主要定位于细胞质。结论该TBI大鼠模型所致的病理改变成功模拟出临床颅脑创伤的多个重要特征,且重复性好,为进一步的实验研究奠定了基础。TBI可诱导脑组织中内源性MANF蛋白的表达上调,并广泛体现在不同的部位和细胞中,可能是急性期脑组织自身的保护性调节机制。第二部分MANF对TBI大鼠的脑保护作用及其初步机制研究第一节重组人MANF对TBI大鼠脑保护作用及其剂量依赖性目的明确MANF蛋白能否在TBI急性期发挥脑保护作用,并初步探讨其剂量相关性。方法96只SD雄性成年大鼠,随机分为对照组(Sham组,n=24)、颅脑创伤组(PBS组,n=24)、小剂量MANF治疗组(MANF 5μg组,n=24)和大剂量MANF治疗组(MANF 20μg组,n=24)。MANF治疗组给予TBI造模大鼠侧脑室注射不同剂量的人重组MANF蛋白(5μg/20μL或20μg/20μL),PBS组给予TBI造模大鼠侧脑室注射相同体积的PBS溶液(20μL),Sham组仅磨除颅骨、不予撞击操作。造模并给药后24小时,各组动物均予以行为学及头颅MRI检查,并选取挫伤灶周围脑组织行免疫荧光(Neu N染色)及脑组织含水量等检测,同时统计每组动物的死亡率。结果创伤后24小时,PBS组大鼠的Garcia评分显著下降、T2 WI图像及脑组织含水量提示脑水肿明显、免疫荧光提示挫伤灶周围存活神经元(Neu N阳性)数量较少,且该组动物死亡率较高。应用小剂量MANF进行治疗后,上述指标均较PBS组有所好转,但差异无明显统计学意义。而应用大剂量MANF进行干预后,上述指标均较PBS组明显好转,除死亡率外,均具有显著统计学差异(P0.05)。结论TBI早期应用MANF蛋白进行干预治疗,可减轻大鼠脑组织的急性期病理损害、降低其致残率和死亡率,具有脑保护作用,且在一定范围内大剂量效果更明显。第二节重组人MANF抑制TBI大鼠继发性神经炎症反应及降低血脑屏障通透性目的通过观察MANF蛋白治疗后大鼠脑组织中的炎症指标、p65表达及血脑屏障改变,初步探讨MANF在TBI急性期脑保护作用的部分机制。方法将54只SD雄性成年大鼠,随机分为对照组(Sham组,n=18)、颅脑创伤组(PBS组,n=18)和MANF治疗组(n=18)。在MANF治疗组中,将20μg/20μL人重组MANF蛋白注射到TBI模型大鼠的侧脑室中。在PBS组中,将相同体积的PBS溶液注射到TBI模型大鼠的侧脑室中。Sham组仅磨除颅骨、不予撞击操作。造模后24小时,选取挫伤灶周围脑组织行免疫荧光(CD68染色)、逆转录PCR及免疫印迹检测,阐明MANF对小胶质细胞和促炎因子(如IL-1β、TNF-α等)活化和NF-κB通路蛋白(p65)表达的影响;此外,活体静脉注射EB染液以确定MANF蛋白对血脑屏障通透性的调节作用。结果创伤后24小时,PBS组大鼠挫伤灶周围小胶质细胞被激活,胞体变大,且数目明显增加,与Sham组相比具有显著统计学差异(P0.01);而应用大剂量MANF干预后,活化小胶质细胞数量减少(P0.05)。同时PBS组挫伤灶周围IL-1β、TNF-α及p65表达水平明显升高;应用大剂量MANF干预可显著降低其表达程度(P0.05)。此外,在PBS组的挫伤灶周围观察到明显EB染料渗出,与Sham组相比具有显著统计学意义(P0.01);而在大剂量MANF的干预下,EB染料渗出明显减少(P0.05),急性期血脑屏障的通透性显著降低。结论MANF可通过抑制TBI急性期的细胞和递质炎症反应发挥脑保护作用,此机制可能与NF-κB通路活性的抑制密切相关。而MANF维持急性期血脑屏障的稳定性,可能是其脑保护作用的另外一种途径。
【图文】：

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图 1 大鼠 TBI 模型制作装置（改良 Feeney′s 方法）Fig.1 The apparatuses setting up the TBI model of rats (improved Fmethod)神经行为功能评分究采用改良的 Garcia 评分来反映颅脑创伤后大鼠的行为变化，并损伤程度。实验采用双盲法，，评分列表中包括 6 项检测内容，包体感觉、运动、反射和协调性等方面。前 3 项评分为 0-3 分，后3 分，总分最低分为 3 分、最高分为 18 分。检测得分愈低则表示神重，以 3 次重复检测结果的平均分为最终得分，每次检测过程间检查内容与评分如下：运动（将大鼠放入笼中 5 分钟）：0. 无自主运动；1. 很少运动；

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图 2 大鼠 TBI 后 24 小时神经行为学评分的改变Fig.2 The modified Garcia score of rats in different groups at 24 hours after traumaData are expressed as mean ± SD. n=6. **P<0.01, compared with the Sham group. TBI 后头颅 MRI 的表现在活体大鼠上直观的了解 TBI 后脑组织的损伤程度和范围，于创伤后 24头颅 MRI 检查，通过 T2 WI 图像予以反映。我们发现与对照（Sham）组I 组在右侧额顶叶可见明显的皮层连续性中断，其周边存在弥漫性高信号变、局部脑肿胀明显，伴有同侧脑室的受压和闭塞，但对侧大脑半球却信号及形态的异常表现。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R651.15

【参考文献】