急性跟腱断裂伤组织、血清蛋白质组学研究

发布时间：2020-04-15 09:49

【摘要】：目的:急性闭合性跟腱断裂往往发生在腱病(Tendinopathy或Tenositis)的基础上,将本病者与正常跟腱者的跟腱组织、血清进行定量蛋白质组学分析,发现跟腱伤者与正常跟腱者的跟腱组织、血清有哪些差异蛋白,阐明这些差异蛋白与本病发生之间的联系,从而进一步对本病病理基础给以精确的阐释,探讨本病病因关键靶标的作用机理,同时为本病提供早期预警、诊断以及预后的新方法、新技术。方法:正常人跟腱组织、血清,急性闭合性跟腱断裂患者跟腱组织、血清各15例,组内样本随机混合成3个生物学重复,对跟腱组织和血清进行i TRAQ差异蛋白质组学分析,得到的结果与数据库进行比较,对蛋白进行注释。应用生物信息学软件对差异表达的蛋白进行GO(Gene ontology)功能分析和KEGG通路分析以本病相关的目标蛋白。并用免疫组化对其中部分差异蛋白进行验证。结果:实验一:1.本次实验跟腱组织共鉴定到蛋白质组(Protein group)2439个,其中符合表达差异倍数大于1.2倍(上下调)且P值小于0.05的有410个,其中急性闭合组与正常组比较上调蛋白共210个,下调蛋白共200个。其中载脂蛋白A4(Apolipoprotein A-IV APOA4),整合素β_2(Integrin beta-2 ITGβ_2),假定β-肌动蛋白样蛋白3(Putative beta-actin-like protein3 POTEKP),肌球蛋白调节轻链2(Myosin regulatory light chain 2 MYL2),纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor 1 SERPINE1),富含亮氨酸重复序列和钙调理蛋白同源性结构域蛋白4(Leucine-rich repeat and calponin homology domain-containing protein 4 LRCH4),Ⅱ型胶原α-1链(Collagen alpha-1(II)chain COL2A1),整合素β_3(Integrin beta-3 ITGβ3),纤维连结蛋白(Fibronectin FN1)等一系列蛋白参与的信号通路被显著富集,并且每个蛋白都参与多个信号通路,可以做为重点研究对象。在KEGG分析中,对上述组织中410个差异蛋白经过KEGG数据库检索,共检索到240个信号通路。2.血清共鉴定到蛋白质组(Protein group)554个,其中符合表达差异倍数大于1.2倍(上下调)且P值小于0.05的有44个,其中急性闭合组与正常组比较上调蛋白共19个,下调蛋白共25个。其中载脂蛋白A4(Apolipoprotein A-IV APOA4),丙酮酸激酶(Pyruvate kinase PK),过氧化物酶1(Peroxiredoxin-1 PRDX1),磷酸甘油酸激酶1(Phosphoglycerate kinase 1 PGK1),抑制蛋白-1(Profilin-1 PFN1)等一系列蛋白既是差异蛋白,同时也是结点最多的蛋白,后续可以做为重点研究的对象。对上述血清44个差异蛋白经过KEGG数据库检索,共检索到82个信号通路。实验二:运用免疫组织化学实验观察分析,对15例正常跟腱组和15例急性跟腱断裂者的跟腱组织标本进行免疫组化验证实验。两组标本经甲醛固定、石蜡包埋、备切片、脱蜡、水化、内源酶清除、再通过高温高压抗原修复、一抗孵育、二抗孵育、还通过DAB显色和苏木素复染,脱水封片等一系列过程。对APOA4、CollagenⅠ、CollagenⅡ、CollagenⅢ等蛋白的显著差异表达进行检测观察。APOA4在正常跟腱组织弱阳性表达,急性跟腱断裂病理组织中至强阳性表达,APOA4大多呈弥漫失极性表达,呈棕黄色颗粒,位于胞浆内,部分细胞出现细胞核着色。APOA4在正常跟腱组织的阳性表达率为73.3%,在急性跟腱断裂者病理组织中的阳性表达率为93.3%,急性跟腱断裂者病理组织的表达强度明显高于正常组织,与iTRAQ结果基本一致。?~2值为3.21,P值为0.201,因样本量少等原因未得到统计学差异。CollagenⅠ,CollagenⅢ在正常跟腱组织中至强阳性表达,急性跟腱断裂病理组织弱至中阳性表达,大多呈弥漫性表达,呈棕黄色颗粒,位于细胞浆内。CollagenⅠ在正常跟腱组织的阳性表达率为93.3%,在急性跟腱断裂者病理组织中的阳性表达率为86.7%,CollagenⅢ在正常跟腱组织的阳性表达率为93.3%,以上胶原蛋白在急性跟腱断裂者病理组织的表达强度低于正常组织,与iTRAQ结果基本一致,CollagenⅡ在正常跟腱组织弱至中阳性表达,急性跟腱断裂病理组织弱至中阳性表达,大多呈弥漫性表达,呈棕黄色颗粒,位于细胞浆内。CollagenⅡ在正常跟腱组织的阳性表达率为86.7%,在急性跟腱断裂者病理组织中的阳性表达率为80.0%,在正常组织与病理组织的表达强度无明显差异。CollagenⅠ的?~2值为2.152,P值为0.341,CollagenⅡ的?~2值为0.759,P值为0.684,CollagenⅢ的?~2值为0.733,P值为0.693。因样本量少、个体差异等原因未得到统计学差异。结论:1本研究基于iTRAQ技术对急性跟腱断裂伤者组织和血清进行蛋白组学分析,得到了跟腱组织和血清的差异蛋白表达图谱,从而为探讨急性跟腱断裂病因列举了大量实用的分子生物学资料。2急性闭合性跟腱断裂往往发生在腱病的基础上,推测APOA4,ITGβ_2,SERPINE1,POTEKP,ITGβ3,FN1,LRCH4,COL2A1,PK,PRDX1,PGK1,FN1等一系列蛋白质参与了腱病进程,并减低了跟腱的柔韧性,有一定的临床意义。3运用免疫组织化学实验观察分析,对正常跟腱组和急性跟腱断裂组跟腱组织标本进行验证实验,目的蛋白APOA4、CollagenⅠ、CollagenⅡ、CollagenⅢ等生物标志物与iTRAQ结果基本一致,说明在前组织中关键靶标稳定存在,进一步确认了蛋白质谱实验的准确性。
【图文】：

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生物信息学分析流程

血清,离子

图 3 肽段离子得分分步图（A:组织；B:血清）Fig. 3 the peptide ion score step map(A:Tissue, B:Serum )
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R686.1

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