Robo4基因表达对内皮祖细胞的影响研究

发布时间：2020-04-20 18:39

【摘要】：随着经济的高速发展,高速率的交通工具已广泛普及,由此带来的创伤发生率也逐年提高。创伤后感染引起脓毒症(sepsis)的几率也大大提高,随之出现多器官功能衰竭(Multiple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)的发生率和死亡率也随之提高~1。现代创伤伤情复杂,死亡率高居不下,创伤患者多为男性青壮年,社会代价极高。因此,创伤被纳为国家疾病控制计划。目前多数学者认为脓毒症的发病基础是全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),继而发生严重脓毒症和脓毒症休克~2。因此,如何防治脓毒症是临床医学面临的一个难题。进入21世纪以来,随着干/祖细胞技术和理论的迅猛发展,严重创伤后脓毒血症及MODS的机制研究也出现了新的契机。研究表明,血液循环中具有多向分化功能的一类祖细胞在炎症因子的刺激下从骨髓中动员并迁徙进入受损的组织中,然后分化成为内皮细胞参与修复。内皮细胞不仅是炎症反应的参与者,还是首先受损的靶细胞。内皮细胞的损伤后造成了内皮功能不全,目前认为这可能是器官功能障碍的始发环节。1997年,Asahara~1等首次分离并证实人外周血存在着能分化为血管内皮细胞的内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),这些细胞具有增殖、迁徙和分化为成熟内皮细胞的能力,人们开始了对内皮祖细胞的各方面研究。内皮祖细胞定居于骨髓,在创伤后或炎症因子的刺激下可以被动员到外周循环,由于其具有大量增殖及向缺血部位归巢的特性,在创伤后参与血管形成修复并维持血管内皮稳定等关键作用。最近研究发现通过进行自体移植EPCs发现,虽然MODS的发生率和死亡率均出现下降,但是外源性EPCs的移植在病态环境下并未有效分化为内皮细胞,削弱了对重要器官的修复功能。提示在脓毒症发生和发展过程中的局部缺血、缺氧的内环境不利于EPCs的定向分化和促进血管内皮的修复。如何使EPC在病态内环境中最大程度定向分化为血管内皮细胞,探索调控EPC定向分化的机制是目前研究的热点。研究发现,Slit2蛋白分布于肺、肝脏和肾脏等重要血管的内皮细胞。Robo4是Slit2蛋白的单次跨膜受体,其特异性表达于血管内皮细胞,参与血管新生和维持血管内皮功能稳定。EPC表明Robo4表达强度和EPC向成熟血管内皮定向分化及维持血管内皮稳定密切相关~3。在小鼠脓毒血症过程中,给予外源性Slit2后,可通过Robo4激活血管内皮钙离子依赖性粘连蛋白(VE-cadherin),防止其被胞内摄取,从而增强血管内皮稳定性,增强内皮细胞之间的粘附力,明显提高脓毒血症小鼠的存活率~4。本研究将探讨在脓毒症发生过程中Robo4基因表达对EPCs数量和功能的影响,及其诱导EPCs定向分化作用,为临床防治脓毒症探索新的治疗靶点提供理论和实验基础。本研究共分为三个部分,首先通过基因敲除技术构建Robo4~(-/+)、Robo4~(-/-)小鼠,通过盲肠穿孔+腹腔注射内毒素(LPS)制造出创伤后基因敲除小鼠的脓毒症模型。然后动态观察创伤后脓毒症发展过程中EPCs内Robo4表达水平和内皮祖细胞数量变化。最后对三种不同基因表达小鼠骨髓来源的EPCs进行体外培养和功能鉴定。第一部分多器官功能障碍小鼠模型的建立目的:建立基因敲除小鼠脓毒症模型,为研究Robo4影响内皮祖细胞增殖和分化提供实验基础。方法:将体重20-25g的Robo4~(-/+)、Robo4~(-/-)和WT三种基因类型的小鼠100只分为2组:实验组(M组)90只,施行腹腔内毒素注射+盲肠穿孔;对照组(C组),施行假手术。观察各组动物的症状、体征、生存率、脏器功能指标(ALT、AST、Cr)、炎性因子(TNF-α、IL-1β、VEGF)并观察主要脏器的大体及显微镜下病理改变。结果:实验组小鼠的症状、体征与功能指标均发生明显变化,肺、肝、心、肾及胃肠道等脏器病理改变严重。实验组和对照组MODS发生率为(82.2%,0),死亡率(75%,10%),显著高于对照组。结论:采用腹腔注射内毒素+盲肠穿孔的方法,可以成功地复制出小鼠脓毒症模型,且有较高的死亡率和可重复的稳定性,并可进一步发展成为MODS。第二部分脓毒症进展过程中EPCs数量的变化及EPCs内Robo4表达水平变化目的:监测脓毒症各个阶段正常小鼠骨髓中内皮祖细胞的数量变化,检测EPCs Robo4的mRNA和蛋白水平变化,探讨Robo4表达水平与EPCs数量变化的相关性。方法:按照第一部分造模后,分别在正常状态下、注射内毒素2小时、4小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时取骨髓,按照密度梯度离心法获得单个核细胞(PMC,peripheral mononuclear cell),按5×10~5PMC/孔的密度种于铺有纤维连接蛋白(FN)的培养板中培养,培养48小时后收集未贴壁细胞,再按1×10~5PMC/孔的密度接种于FN包被的培养板中进行培养,培养72小时进行贴壁细胞的计数。取1×10~5细胞进行裂解,利用RealTime-PCR检测MODS各个阶段EPC中Robo4的mRNA和蛋白水平变化。结果:脓毒症发展过程中,Robo4表达水平逐渐升高,至T4达到峰值,随后逐渐下降;内皮祖细胞的数量先增加,在T5时达到峰值,随后出现明显下降。相关性分析表明,二者在脓毒症进展过程中的变化成正相关。结论:在LPS介导的小鼠脓毒症模型中,Robo4表达水平与骨髓中EPCs数量具有相关性,因此Robo4可能参与调控EPCs的增殖。第三部分三种不同基因表型的小鼠骨髓来源EPCs培养鉴定和功能特征比较目的:对三种不同基因表表型小鼠骨髓来源的EPCs进行分离、培养、鉴定和功能比较。方法:从小鼠骨髓分离出单个核细胞,进行诱导分化培养,对培养至P6代的EPC进行细胞形态学特征、流式细胞仪、双吞噬功能及体外血管形成功能等方法进行鉴定,并对照分析。结果:三种不同基因表达的EPC鉴定如下:贴壁细胞均特异性摄取了Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1,摄取率均超过80%。免疫组化:Robo4~(-/-)组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(++)、KDR(++);Robo4~(+/-)组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++);WT组:CD133(+)、CD34(+)、CD31(+++)、KDR(+++)。流式细胞仪技术鉴定:Robo4~(-/-)组:CD133阳性率:17.25±6.43%;CD34阳性率:48.75±6.83%;CD31阳性率:72.53±12.38%;KDR阳性率:87.25±10.23%;Robo4~(+/-)组:CD133阳性率:16.55±7.29%;CD34阳性率:46.65±7.23%;CD31阳性率:75.93±11.28%;KDR阳性率:89.25±11.33%;WT组:CD133阳性率:18.25±8.57%;CD34阳性率:47.15±5.72%;CD31阳性率:74.61±10.69%;KDR阳性率:88.25±11.35%。体外血管生成功能:Robo4~(-/+)组:28.49±4.38个/HP;Robo4~(-/-)组:25.82±3.62个/HP;WT组:42.32±3.92个/HP(P0.05)。粘附功能:贴壁率(Robo4~(-/+)组:42.7±3.1%;Robo4~(-/-)组:39.5±1.7%;WT组:64.5±2.6%(P0.05))。迁徙功能:迁徙率(Robo4~(-/+)组:18.5±1.7%;Robo4~(-/-)组:13.3±2.6%;WT组:27.5±1.8%(P0.05))。增殖功能:Robo4~(-/+)组:23.06±2.63×10~4;Robo4~(-/-)组:19.24±2.65×10~4;WT组:40.33±3.65×10~4(P0.05)。结论:Robo4~(+/-)、Robo4~(-/-)和WT三种基因来源的EPC的细胞形态和鉴定无明显差别。基因敲除小鼠EPCs的血管形成能力、迁徙功能、粘附功能和细胞增殖能力要劣于野生型组。小结:通过CLP+腹腔LPS注射建立复制小鼠脓毒症模型与临床脓毒症发生的常见诱因和实际过程相近。脓毒症发展过程中Robo4表达水平和内皮祖细胞数量呈上升趋势,而随着死亡的升高,二者逐渐下降。通过对三种基因表达小鼠诱导分离骨髓来源EPCs比较分析,发现Robo4基因敲除小鼠与野生型小鼠的骨髓源性的EPCs在表型鉴定、形态学特征、双吞噬功能基本一致。基因敲除小鼠在迁徙功能、血管形成功能、粘附功能和增殖功能上明显低于野生型小鼠。证实Robo4基因表型对EPCs的部分功能存在调控作用。
【图文】：

质粒图谱,质粒电泳,样本均数,策略

2. 数据处理和统计分析本部分数据采用 SPSS17.0 统计软件分析。肝肾功能和炎症指标的数据采用均数±标准差（ x±s）表示。各组间样本均数采用单因素方差分析（ANOVA），组内比较采用 t 检验，MODS 的发生率和死亡率采用 2检验。以 P＜0.05 为差异具有统计学意义，P＜0.01 为差异具有显著性。二、结果(一) 基因敲除小鼠鉴定培育1.质粒构建及打靶策略完成构建的打靶质粒用限制性内切酶及测序鉴定同源臂插入及方向，打靶质粒图谱见图 1-1。用 PvuI 线性化后用于胚胎干细胞打靶，打靶策略见图 1-1。

示意图,条件性,胚胎干细胞,同源重组

图 1-2 Robo4 条件性基因剔除示意图（2）同源重组 ES 细胞鉴定胚胎干细胞打靶，实际电压为 256V，放电时间为 10ms，共获得抗性克隆 190。通过抽提 96 孔板中胚胎干细胞的基因组 DNA 后，，进一步通过 PCR 筛选阳性隆，检测到有 40 个正确同源重组克隆（见图 1-3）。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R641

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