褪黑素通过Septin7诱导内质网应激介导成骨细胞自噬和凋亡的相关性研究

发布时间：2020-04-25 06:05

【摘要】：研究目的:褪黑素是一种主要由松果体合成的激素,与骨科疾病如特发性脊柱侧凸(idiopathic scoliosis,IS)的发生和发展密切相关。现有的研究尚不能明确地阐明褪黑素分泌量和节律性与特发性脊柱侧凸和骨质疏松症发生发展的关系,及补充褪黑素是否能阻止上述疾病的发展。我们的前期实验证实,褪黑素对成骨细胞具有双重效应,并存在浓度依赖性,低浓度褪黑素促进成骨细胞增殖,而高浓度褪黑素抑制成骨细胞增殖。经过我们的实验验证:低浓度褪黑素作用于成骨细胞褪黑素受体,与G蛋白结合,激活IP3,引起Ca~(2+)浓度上升,通过调节CaMKs/MEK/ERK通路,促进成骨细胞的增殖;随着褪黑素浓度的增加,达到较高浓度时,上述机制被抑制,激活细胞膜钙离子通道,细胞外钙离子进入细胞内,导致细胞内钙离子浓度稳态失调,引起钙超载,进而抑制成骨细胞增殖。我们前期也证实高浓度褪黑素可以引起钙超载,抑制成骨细胞增殖,诱导凋亡。本课题拟在前期研究的基础上,全面深入探讨褪黑素诱导成骨细胞凋亡的作用机制,阐明褪黑素通过Septin7诱导的成骨细胞内质网应激与细胞自噬和凋亡的相关性,为褪黑素治疗特发性脊柱侧凸提供理论依据及新的思路。研究方法:1、MTT检测褪黑素对成骨细胞增殖的影响;2、Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术检测褪黑素对成骨细胞凋亡率;3、Hoechst33342染色检测褪黑素对细胞核内染色质凝集的影响;4、MDC染色观察褪黑素对成骨细胞自噬的影响;5、应用Septin7 siRNA沉默Septin7表达,证实褪黑素作用于Septin7引起成骨细胞内质网应激;6、SEPT 7过表达质粒,转染到Septin7 siRNA稳定的成骨细胞中,进一步证实褪黑素作用于Septin7引起成骨细胞内质网应激7、应用于内质网应激抑制剂4PBA、自噬抑制剂3MA,阐明褪黑素诱导的成骨细胞内质网应激与细胞自噬和凋亡的相关性,研究结果:1、高浓度褪黑素抑制成骨细胞增殖MTT结果发现高浓度褪黑素(1、2、4、8mmol/L)作用成骨细胞24h、48h、72h后,细胞增殖率均有下降,其中较高浓度(2、4、8mmol/L)作用6h后,细胞增殖率也有下降,且与对照组相比差异有统计学意义(P0.05),其中褪黑素浓度为2mmol/L作用时间为24h时,细胞增殖率明显下降。2、高浓度褪黑素诱导成骨细胞凋亡Annexin V-FITC/PI双标染色流式细胞术显示,当褪黑素作用成骨细胞24h,浓度达到2mmol/L时,成骨细胞早期及晚期凋亡明显增加,并随褪黑素浓度增大而增加,与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。单独应用内质网应激抑制剂4PBA及自噬抑制剂3MA对细胞凋亡无明显影响,当联合高浓度褪黑素作用于成骨细胞时,其诱导的凋亡程度明显增强。3、高浓度褪黑素引起成骨细胞核内致密浓染,产生凋亡小体Hoechst33342荧光染色结果显示,当1mM褪黑素作用成骨细胞24h,细胞核出现致密浓染,浓度达2mM及以上时,细胞形态上可见部分细胞呈碎块状致密浓染,并产生凋亡小体,细胞凋亡明显。4、高浓度褪黑素诱导成骨细胞自噬单丹磺酰尸胺MDC染色结果显示,2mM褪黑素作用成骨细胞24h,细胞内可见荧光强度明显增强的自噬小体。5、褪黑素诱导成骨细胞内质网应激与自噬和凋亡的相关性Western blot结果显示,2mM褪黑素作用成骨细胞24h、48h,可以引起凋亡标志蛋白PARP-1的切割。同时发现2mM褪黑素作用成骨细胞6h、24h、48h,均可以引起自噬标志性蛋白LC3-II的表达上调及内质网应激标志性蛋白GRP78和CHOP的表达增加。单独应用内质网应激抑制剂4PBA时对细胞凋亡标志蛋白PARP-1无明显影响,当4PBA及自噬抑制剂3MA联合高浓度褪黑素作用于成骨细胞时,可以增加其诱导的凋亡程度。6、Septin7与褪黑素诱导内质网应激的相关性为更好地了解褪黑素诱导的成骨细胞septin7与褪黑素诱导内质网应激的关系,septin7 siRNA干扰septin7的表达,结果发现,转染siRNA septin7成骨细胞可显著降低GRP 78和CHOP的表达,即使与褪黑素联合使用,变化也不显著,证实褪黑素介导的ER应激诱导成骨细胞增殖是通过作用于septin7的表达。我们还研究了外源表达的septin7是否能逆转septin7基因敲除引起的GRP 78的抑制和CHOP的表达,通过septin7过表达质粒转染siRNA septin7成骨细胞,Westernblot检测7、GRP78和CHOP蛋白水平。如图8A,B所示,在褪黑素诱导的siRNA septin7成骨细胞中,外源性septin7恢复了septin7的表达,我们还发现,成骨细胞的GRP 78和CHOP表达明显高于对照组,但是一个有趣的发现是septin7的表达并没有改变。研究结论1、高浓度褪黑素作用于成骨细胞,抑制成骨细胞增殖,引起成骨细胞发生内质网应激,引起成骨细胞发生自噬,诱导成骨细胞凋亡。2、内质网应激与自噬出现在高浓度褪黑素作用的早期,二者共同起到保护细胞的促存活作用,后期过度内质网应激引起自噬性凋亡诱导成骨细胞凋亡,而septin7是褪黑素诱导的内质网应激的靶蛋白。
【图文】：

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中国医科大学博士学位论文3 实验结果.1 高浓度褪黑素抑制成骨细胞增殖人成骨细胞系 hFOB1.19 是一种非常好的细胞增殖研究模型。我们的前期实实，低浓度褪黑素可以促进成骨细胞的增殖。为了研究高浓度褪黑素对成骨细殖的影响，我们进行了 MTT 实验。如图 1 所示，MTT 结果表明：高浓度褪黑素(1、2、4、8mmol/L)作用成骨细h、48h、72h 后，细胞增殖率均有下降，其中较高浓度(2、4、8mmol/L)作用，细胞增殖率也有下降，且与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05)，其中褪浓度为 2mmol/L 作用时间为 24h 时，细胞增殖率明显下降。

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中国医科大学博士学位论文3.2 高浓度褪黑素诱导成骨细胞凋亡如图 2 所示 Annexin V-FITC/PI 双标染色流式细胞术显示，当褪黑素作用成骨细胞 24h，浓度达到 2mmol/L 及 2mmol/L 以上时，成骨细胞早期及晚期凋亡明显增加，并随褪黑素浓度增大而增加，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R682.3

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