间充质干细胞外泌体通过抑制BACH1促进HO-1影响椎间盘退变的机制研究

发布时间：2020-05-05 03:53

【摘要】：研究背景与目的下腰痛(Low Back Pain,LBP)在临床上较为常见,是门诊患者就诊的常见病因之一~([1])。下腰痛严重影响患者生活质量,并且给社会和个人造成巨大的经济损失~([2])。目前,如腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症及退变性侧凸等,被公认的是引起下腰痛主要疾病。通过大量的研究证实,这些疾病均与椎间盘退变(Intervertebral DiscDegeneration,IDD)及其继发的病理改变有关~([3])。下腰痛在我国的发病率逐年加剧,随着社会老龄化,腰椎退变性疾病患者亦呈递增趋势。目前在临床上,针对椎间盘疾病,最主要的治疗手段仍然是手术治疗~([4])。手术治疗可以有效的缓解临床症状,但是手术并不能从根本上修复已经退变的椎间盘,并且有可能产生严重并发症,给病人带来更大的痛苦。因此对椎间盘退变机制及生物治疗的深入研究具有十分重要现实意义。椎间盘的解剖结构分为,中央的髓核、外侧的纤维环及上下两端的终板构成;椎间盘的主要功能为维持正常的脊柱结构,承担脊柱的生物应力~([5])。髓核组织正常的含水量为椎间盘发挥生理功能、承担应力的必要前提,椎间盘退变早期的影像学表现,即为MRI下T2加权像上髓核组织含水量减少,由高信号逐渐转变为低信号甚至无信号~([6])。而含水量的减少,目前认为是由于细胞外基质的破环导致。含水量减少引起椎间高度降低,局部运动节段不稳,最终导致髓核突出,神经根管狭窄等病理变化从而压迫局部神经引起腰痛~([7])。目前不少针对椎间盘退变的临床研究都是根据其影像学上髓核含水量的变化来判断椎间盘退变进程的~([8]),这也是临床工作中判断椎间盘退变的重要指标之一。研究表明,椎间盘髓核细胞凋亡增加,炎症因子的大量侵入,髓核中细胞外基质(Extracelluar matrix,ECM)的代谢紊乱等是导致其发生退变的主要原因。大量研究结果证明,而在这些原因之中,髓核细胞外机制合成分解代谢紊乱被认为是最主要的引起椎间盘退变的机制~([9])。NP细胞在ECM代谢中起着关键作用,可分为两个方面。关于合成代谢,ECM的主要成分是Ⅱ型胶原(COL-Ⅱ)和蛋白多糖~([10])。蛋白聚糖是必不可少的椎间盘的蛋白多糖的组成部分,与大量的硫酸化糖胺聚糖(sGAG)侧链~([11]);这些分子使椎间盘具有凝胶特性,使其保持水分和机械支持能力。这些基质基因在IDD的表达下降已被研究者报告,表明在IDD中合成代谢的减少~([12,13])。在分解代谢方面,以往的研究表明基质金属蛋白酶(MMPs)和聚蛋白多糖酶(ADAMTS)在IDD中上调,这是IDD中ECM降解的主要原因。近年来,再生医学以及生物治疗,成为研究热点~([14])。对于椎间盘退变的生物治疗和再生医学的相关研究,也聚焦于具有修复及多向分化潜能的干细胞身上。该类治疗方法通过注射等手段,将具有修复能力的干细胞直接作用于退变的椎间盘组织,促进椎间盘内细胞数量的恢复以及基质的再生,最终起到改善退变,甚至逆转退变进程的治疗效果~([15])。目前,针对椎间盘退变的再生治疗手段,以间充质干细胞为主。间充质干细胞具有多向分化潜能、组织替代、调控微环境、影响局部免疫及炎症反应等特性,同时间充质干细胞来源多样,不同来源间多能性存在差异等特性。间充质干细胞相关的再生治疗的研究非常广泛,并且取得了很多积极的结果,然而间充质干细胞治疗存在来源获取难、细胞易衰老、具有潜在致瘤性等弊端,极大地限制了间充质干细胞的再生医学研究及应用。所以,基于干细胞治疗的局限性,更多的研究者将目光投向间充质干细胞所分泌产生的一种物质——外泌体上。外泌体是由细胞分泌的纳米级囊泡,囊泡内包含编码RNA,非编码RNA,蛋白质,抗原递呈因子,以及DNA~([16,17])。由于其具有双层膜结构,能够很容易地穿透细胞膜达到将内容物进行细胞间转导的效果,通过传递蛋白质和RNA,外泌体可以调节受体细胞和其他器官的功能、活动~([18])。JCI也于2016年做专刊对外泌体的发现、作用以及对未来应用上的展望做了系统综述。目前,外泌体的再生效应,已经在其他组织和器官损伤修复的研究中得到验证,包括心脏损伤治疗、肺部损伤治疗、肝脏再生治疗、骨折愈合、脑卒中后再生治疗等~([19,20])。但是间充质干细胞外泌体能够促进椎间盘退变的修复,其效果与干细胞治疗相比优势如何等,目前仍在研究阶段,仅有少量报道。因此本课题针对上述情况,拟对间充质干细胞来源外泌体在椎间盘髓核细胞退变过程中的作用进行系统研究,力求通过该研究发现治疗椎间盘退变的新的手段,为今后的再生医学相关治疗研究打下基础。第一部分:间充质干细胞外泌体的分离与鉴定方法:采集非开放性股骨骨折外伤患者股骨内的新鲜骨髓标本,按照Percoll密度梯度离心方法,分离和收集有核细胞,在5%的CO_2和37℃条件下,使用含15%胎牛血清的DMEN培养基静止培养,细胞达90%融合时可以传代。利用流式细胞术、以及诱导分化,鉴定干细胞特性。细胞传代至P2代后,将间充质干细胞接种于T75以上培养瓶中进行扩增,待细胞融合度达到90%时,更换低外泌体血清培养基,每2天换液收集培养基,连续收集,对收集到的培养基使用超速离心机多次离心,抽提外泌体。对收集到的外泌体,使用电镜扫描及Nanosight分析外泌体的性状,使用Western Blot,检测外泌体中特定的蛋白表达情况,使用融合试验明确外泌体的融合能力。结果:成功培养出状态良好的骨髓来源间充质干细胞7例。流式细胞试验测得CD29、CD90~+、CD44~+,CD105~-、CD14~-,CD34、CD45不表达等干细胞标志物,证明所得细胞符合国际标准。将原代细胞进行成骨及成脂诱导,原代细胞中显示出明显的钙结节及脂肪滴,证明其多项分化潜能。细胞传代至P2代后,用低外泌体血清培养基大量培养并收集上清,用超速离心法收集抽提外泌体。用Western Blot方法检测收集到的外泌体中CD81及CD63的表达情况,同时Nanosight及电镜检测外泌体的大小形态及纯度,证明所收集得到的确定为纯度较高的外泌体。将所得外泌体用PKH67染料染色并加入到MSC中,结果显示外泌体可将MSC染色,证明其膜融合能力。结论:完成骨髓间充质干细胞的原代培养,并通过相关试验验证,所获细胞符合间充质干细胞国际标准。传至P2代后,更换使用低外泌体血清培养基并收集,用超速离心的方法抽提外泌体,并验证其确为外泌体。第二部分:MSC外泌体对退变椎间盘的作用方法:根据试验设计,收集满足条件的人髓核组织进行原代培养。通过CCK-8增殖试验,验证所得外泌体是否存在细胞毒性,以及其促进髓核细胞增殖能力。试验分组:设对照组为超速离心后的上清液作为去外泌体上清作组;设阴性对照组为HEK293细胞按照上述方法培养并收集上清进行超速离心收集得到的外泌体;设空白对照组为超速离心后未培养过细胞的原始培养基;设实验组为间充质干细胞来源外泌体组。测定各样本蛋白量,将不同浓度的样品加入髓核细胞中,培养24h后,使用Western Blot、PCR以检测处理后细胞外基质分泌表达情况。同上述方法处理,验证与髓核细胞外基质降解相关MMP、ADAMTS的表达情况,以及髓核细胞外基质合成相关基因的表达情况。使用高通量测序技术,找寻靶基因,分析外泌体对髓核细胞体外退变过程的影响。结果:成功建立体外髓核细胞系5株。通过增殖试验证明MSC外泌体对NP细胞不仅没有细胞毒性,试验结果同时还证明MSC外泌体还具备提高髓核细胞增殖的能力。分组处理后,通过Western Blot、PCR等试验方法验证,实验组的髓核细胞较对照组及阴性对照组中,2型胶原、蛋白聚糖表达量显著上调,分解代谢相关MMP1、MMP2、MMP7表达虽然没有显著下调,但是合成相关的ACAN、COLII、CHSY表达显著上调。高通量转录组测序,证明MSC外泌体处理后NP细胞转录组水平基因表达与对照组相比存在显著差异。结论:获得正常人髓核细胞系5株。增殖试验证明MSC外泌体对NP细胞不具备细胞毒性,同时具有提高NP细胞增殖的能力。分组定量处理细胞,并使用Western Blot、PCR方法检测,发现间充质干细胞来源外泌体具有促进细胞外基质合成,上调髓核细胞细胞外基质合成酶以及下调细胞外基质降解酶的表达。第三部分:MSC外泌体上调HO-1影响椎间盘退变的机制研究方法:(1)根据高通量RNA测序结果筛选候选靶基因。(2)结合MSC外泌体高通量miRNA测序数据,利用生物信息学分析MSC外泌体中miRNA成分对靶基因的影响。(3)筛选与BACH1结合的、MSC外泌体处理后高表达的miRNA,并对结合进行验证。(4)研究筛选出的miRNA对BACH1、HO-1表达的影响。(5)明确MSC外泌体通过microRNA对突变BACH1的结合位点的影响。结果:(1)MSC外泌体处理后,NP细胞低氧相关基因表达存在明显差异。(2)MSC外泌体能够显著上HO-1表达,而HO-1抑制性BACH1的表达则显著下调。进一步的miRNA测序数据显示MSC来源外泌体中高峰度miRNA均与BACH1存在相互作用,提示其功能可能通过抑制BACH1来发挥。(3)通过miRNA实时定量PCR检测发现外泌体处理后的髓核细胞其BACH1抑制性miR-21、-23、-125、-let7均出现明显上调。(4)利用miRNA模拟物进行miRNA过表达,结果显示上述候选miRNA均能不同程度抑制BACH1表达。(5)MSC外泌体中miR-21、-23、-125、-let7能够直接抑制BACH1的表达,促进HO-1表达,影响椎间盘退变。结论:证实MSC外泌体促进IDD中ECM合成的作用,是通过miRNA等转录后调控因子来实现。证实对BACH1存在抑制性的miR-21、-23、-125、-let7,在MSC外泌体处理后上调,发现了外泌体上调HO-1的作用机制。小结本研究首次发现了外泌体中所含有的BACH1靶向性miRNA因子能够改善椎间盘退变。我们发现了miR-21、-23、-125、-let7在外泌体处理后的髓核细胞中表达显著上调,而通过功能学验证明确了上述miRNA确实能够引起BACH1表达的变化,从而引起HO-1活性的增高,促进椎间盘退变的修复。通过上述研究启发了关于HO-1的调控机制。在前期针对HO-1修复椎间盘退变的基础进一步通过MSC来源外泌体丰富了HO-1的调控机制,此外也通过该研究进一步证明了MSC来源外泌体促进椎间盘修复的机制。
【图文】：

骨髓,相差显微镜,生长情况

分离、收集有核细胞进行原代培养。1天后显微镜下可观察到少量梭形小细胞贴壁生长。而后继续可观察到典型的细胞形态和细胞集落，与国际标准一致。细胞多次传代后骨髓MSC出现现衰老倾向。本课题组选用P2代进行试验研究，见图1-1。图1-1 相差显微镜下观察P2、P4、P6的骨髓MSC细胞生长情况(200X)。（二）骨髓MSC性质鉴定

表面标记物,诱导分化

CD34、CD45 不表达，符合国际标准，证明确为骨髓 MSC，见图 1-2。图1-2 流式细胞学检测MSC表面标记物然后验证其多向分化潜能。成骨诱导10天、21天，茜素红染色，MSC中可见明显的鲜红色团块，证明出现钙质沉积，提示细胞已诱导分化为具有骨质沉积的骨前体细胞。成脂诱导10天、21天后，油红O染色30min，MSC中内出现染为红色的脂滴，，证明MSC细胞已诱导分化为脂肪前体细胞。图1-3 细胞染色鉴定MSC诱导分化情况，上为成骨诱导后茜素红钙结节染色情况（200X），下为成脂肪诱导后细胞内脂肪滴染色（400X
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5

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