MD2在膝骨关节炎组织损伤及疼痛形成中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-05 10:00

【摘要】：膝骨关节炎(KOA)是一种以关节疼痛、关节肿胀及功能障碍为主要临床表现的慢性退行性疾病,在成年人中发病率高达21%,是临床最常见的慢性疾病之一。由于膝骨关节炎的高发病率、高致残率和漫长的病程,给患者生活带来严重影响,也给社会和医疗带来了沉重的负担。目前临床主要以药物治疗和手术治疗结合为主,尚无修复关节软骨损伤的有效方法。药物治疗主要为非甾体类抗炎药,可一定程度上缓解疼痛,抑制炎症反应,但并不能有效阻止膝关节软骨的退变,而且长期服用此类药物可能会对人体消化系统及肝、肾功能造成损害。症状严重者只能施行手术置换人工关节,花费巨大,且具有一定风险。因而开发安全有效、副作用小的能够减轻疼痛并抑制KOA发生发展的药物和措施迫在眉睫。针灸是中华民族的宝贵财富,已有研究证实电针可以改善KOA患者的疼痛评分。但由于针刺治疗的作用机制尚不明确,目前并未广泛推广使用。因此寻找针刺治疗KOA的新靶点、探索可以替代针刺治疗的新方法仍然十分必要。近几年研究表明年龄、创伤、肥胖、遗传是骨关节炎的主要危险因素,而炎症反应作为上述骨关节炎危险因素的共同作用途径,在其发生发展过程中具有十分重要的作用。前期研究证实,在KOA中,炎症反应参与了滑膜损伤、软骨退化以及痛觉敏化的形成。其中TLR4通路被认为是关节炎发生发展中的关键炎性通路,已有多种小分子化合物被证实可通过阻断关节局部TLR4通路、减轻软骨损伤,不过由于缺乏特异性、作用效果有限等原因,尚未有临床研究验证其效应。髓样分化蛋白2(MD2)是TLR4信号通路激活所必须依赖的辅助因子,锚定于细胞表面,提供TLR4的结合位点,易化TLR4的级联反应,由此导致下游NF-κB强烈活化,释放大量炎症因子,引发细胞因子瀑布式级联反应。在KOA中,腰段脊髓内MD2的表达及变化如何,以及是否参与了针刺的治疗作用,尚未见报道。本研究首先建立了小鼠的KOA实验动物模型,并在该模型中探索了电针对KOA的治疗作用以及脊髓背角内MD2的表达变化。同时,利用MD2基因敲除小鼠、MD2基因过表达或沉默的慢病毒以及MD2特异性拮抗多肽等方法,探究阻断MD2对KOA及其痛行为的治疗作用,为临床慢性疼痛防治提供新的靶点。实验一电针对MIA所致膝骨关节炎的治疗作用【目的】1.建立小鼠膝骨关节炎模型并筛选稳定模型所需的碘乙酸盐(MIA)剂量。2.探究电针对MIA所致小鼠KOA的治疗作用。【方法】1.8周龄C57小鼠分为0.3mg MIA组、1.0mg MIA组及生理盐水对照组,分别于膝关节腔注射前,注射后1d,3d,7d和14d测量患肢痛行为(机械缩足反射阈值、双足承重差异测试)、患侧膝关节直径及关节损伤程度(OOCHAS病理评分)。2.选择1.0mg MIA作为造模剂量,在造模前及造模后7d、14d,利用上述同样的方法检测电针对KOA小鼠患肢痛行为以及关节损伤程度的治疗作用。【结果】1.1.0mg MIA造模组痛行为、关节损伤及肿胀程度较0.3mg MIA造模组变化更显著,更稳定,且1.0mg组各行为学与病理结果之间的发展阶段具有一致性,对照组注射盐水并未对小鼠膝关节产生明显影响。2.电针组MIA造模后小鼠患肢痛行为(机械缩足反射阈值、双足承重差异)均显著改善,但关节肿胀及病理损伤程度并未明显减轻。【结论】1.选定1.0mg MIA作为后续实验的小鼠膝骨关节炎造模剂量。2.电针可改善MIA所致小鼠膝骨关节炎的痛行为。实验二脊髓背角中MD2参与电针对膝骨关节炎的镇痛作用【目的】1.探究在膝骨关节炎疾病过程中小鼠腰段背角处MD2的表达变化及细胞定位。2.探究脊髓背角中MD2是否参与了电针对膝骨关节炎的镇痛作用。【方法】1.利用Western Blot及免疫荧光染色对正常小鼠以及KOA小鼠MIA注射后6h,12h,1d,3d,7d,14d时腰膨大处脊髓背角中MD2表达水平进行检测,同时利用免疫荧光双标染色对小鼠在KOA后脊髓背角不同类型细胞(神经元,星形胶质细胞和小胶质细胞)中的表达变化进行检测。2.在小鼠KOA模型中,利用Western Blot检测电针治疗下后小鼠第7天脊髓背角中MD2的表达变化。随后利用病毒上调脊髓背角中MD2的表达后,检测造模后7d和14d小鼠患肢机械缩足反射阈值与双足承重差异。【结果】1.Western Blot及免疫荧光染色结果显示KOA小鼠腰膨大处脊髓背角患侧与对侧MD2水平在MIA注射后3d均升高,7d达到最高峰,14d降低。同时免疫荧光双标结果显示升高的MD2主要表达在脊髓背角神经元中(NeuN~+),而小胶质细胞(Iba1~+)与星形胶质细胞(GFAP~+)中,MD2含量较少。2.Western Blot结果显示电针治疗后,小鼠腰段脊髓背角内MD2的表达在造模后7天显著降低。同时上调脊髓背角MD2的表达,可以逆转电针对KOA的镇痛作用。【结论】1.脊髓背角内MD2在KOA早期表达明显增高,7天达高峰,14的开始降低,且增高的MD2主要表达在神经元中。2.电针可以显著降低KOA造模后MD2表达的上调,此外利用病毒上调脊髓背角中MD2的表达可逆转电针的镇痛作用。实验三敲除或特异性阻断MD2对膝骨关节炎及痛行为的影响【目的】探究全身或脊髓局部MD2敲除或特异性功能阻断能否减轻KOA小鼠关节损伤及疼痛表现。【方法】1.8周龄MD2~(-/-)、MD2~(+/-)与野生型小鼠各十只,分别对KOA模型前、后的足底机械痛阈、双足承重差异、患侧膝关节直径和关节病理OOCHAS评分进行检测;2.利用病毒特异性下调脊髓背角中MD2的表达,观察MD2下调组的痛行为及关节肿胀程度是否有所改善,并比较单侧下调组与双侧下调组是否有差异;3.合成可特异结合MD2从而干扰其功能的Tat-CIRP,在KOA造模后前七天通过锁骨下静脉给予Tat-CIRP(30mg/kg),观察上述四项指标是否有所改善;4.考虑到全身给药的非特异性,直接采用鞘内给予小剂量(3mg/kg)Tat-CIRP,观察对KOA痛行为和关节损伤的作用。【结果】1.MD2~(-/-)小鼠在KOA造模后,痛行为学、患侧膝关节肿胀程度及关节病理评分发生明显改善。2.当脊髓背角MD2下调时,小鼠疼痛表现部分改善,关节肿胀程度未见明显变化,且脊髓背角MD2单侧下调组与双侧下调组在痛行为表现上未见明显差异。3.KOA小鼠静脉给予Tat-CIRP阻断MD2功能后相关痛行为学表现及关节病理评分有明显改善。4.鞘内给予小剂量Tat-CIRP后,KOA小鼠足底机械痛阈有明显改善,双足承重表现有部分改善,但不显著(P=0.0650),而患侧关节直径、关节病理评分并未见明显影响。同时静脉给予同样剂量Tat-CIRP对KOA小鼠相关痛敏行为学表现、患侧膝关节直径及关节病理评分均无治疗作用。【结论】当敲除MD2或特异性阻断MD2功能时,可减轻KOA发生后的痛行为与关节损伤,其中脊髓背角中MD2参与了KOA疼痛的形成。说明MD2是膝骨关节炎治疗的重要新靶点,而我们开发的MD2靶向肽可能成为治疗KOA的新药。
【图文】：

信号通路,骨关节炎

图 1 LPS-MD2-TLR4 信号通路[64]Fig.1 LPS-MD2-TLR4 signaling pathwayR4-MD2 与膝骨关节炎TLR4 与几种疾病均有关联，，且越来越多的证据表明 TLR4 在骨关节炎的发程中发挥着重要的作用。研究证明在骨关节炎软骨细胞中 TLR4 表达增加[在人类和小鼠软骨细胞培养诱导软骨细胞炎症和分解反应中 TLR4 信号通，并伴随着 IL-1β、MMP 的表达增加及一氧化氮释放、前列腺素 E2 的合成实验也表明 LPS 刺激加剧了软骨移植的基质退化[67, 68]。另一方面，LPS 引4 通路活化可以诱发了一种炎症分解性的滑膜细胞表型[68]。有研究证实 TLR4 信号通路在机械应力、合成代谢因子分泌异常以及软骨生的炎症和分解代谢反应中发挥着重要的作用[69]。又如激活小鼠成骨细胞4 信号通路可诱导分解蛋白的表达从而诱发骨关节炎[70]。骨关节炎不仅渐进

实验流程,模型,剂量,军医大学

空军军医大学硕士学位论文模型的 MIA 造模剂量差异较大（从 0.05mg 到 1.0mg），且没有一个统一的推荐剂量，那么在我们的研究中哪一个剂量是最为合适的呢？经过文献筛选，我们选取了0.3mg、1.0mg 这两个常用的 MIA 剂量，通过对疼痛行为、关节肿胀及关节损伤程度的测量选出本实验的最适造模剂量，实验设计如图 1-1。
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R684.3

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