HSP90AA1对骨肉瘤耐药的作用及机制研究

发布时间：2020-05-11 11:04

【摘要】：【背景】骨肉瘤是最常见的骨原发性恶性肿瘤,好发于儿童和青少年。新辅助化疗联合手术的综合治疗方法显著提高了骨肉瘤患者的生存率。常用的化疗药物是顺铂、阿霉素以及氨甲喋呤。在过去的30年中,由于化疗药物耐药的出现,骨肉瘤患者对化疗药物的反应性下降,常常导致骨肉瘤治疗的失败。即使增加药物种类或加大药物剂量,也不能增加这些患者对药物的敏感性,肿瘤仍将较快的出现复发或转移,最终5年生存率会下降到20%。由此可见,化疗药物耐药是出现这种预后不良的主要原因。因此,为了提高骨肉瘤患者生存率,改善预后,深入研究骨肉瘤患者出现化疗药物耐药的分子机制是非常重要的。热休克蛋白家族是一种高度保守的蛋白质,在细胞存活中起着重要作用。特别是在多种应激条件下,例如缺氧、化疗和急性损伤等,热休克蛋白广泛参与多种细胞保护机制。那么,作为热休克蛋白家族的重要成员HSP90AA1,是否参与到骨肉瘤化疗药物耐药中,是本课题的主要研究内容。文献报道,HSP90AA1除了影响肿瘤细胞存活外,还能作用于癌细胞的侵袭和迁移,并与肿瘤的不良预后密切相关。MicroRNAs是一类小的非编码的单链RNA。肿瘤的发生发展过程中常常伴随着miRNAs的异常表达。越来越多的证据表明,miRNAs参与多种肿瘤生物学进程,如增殖、凋亡、侵袭和转移。那么,在骨肉瘤中,是否存在靶向调控HSP90AA1的miRNA,它对骨肉瘤的恶性行为又会有什么影响?在本课题中也将进一步确认。【目的】探索骨肉瘤化疗药物耐药的分子机制,确定治疗靶点,最终提高骨肉瘤患者生存率。确定靶向调控HSP90AA1的miRNA,通过细胞功能学实验进一步确定他们在骨肉瘤侵袭以及转移中的作用。【方法】通过骨肉瘤细胞转染shRNA敲除HSP90AA1基因。通过HSP90AA1过表达慢病毒感染法建立稳定表达内源性HSP90AA1的骨肉瘤细胞系。使用实时定量PCR检测骨肉瘤细胞中HSP90AA1 mRNA表达水平。使用Western blot检测骨肉瘤细胞中HSP90AA1蛋白表达水平。用CCK-8法检测骨肉瘤细胞的增殖率;用Annexin-V/PI染色的流式细胞术测定细胞凋亡率。骨肉瘤细胞自噬的检测方法包括:Western blot检测LC3蛋白表达、透射电镜检测自噬小体生成以及荧光显微镜观察自噬体。mRFP-GFP-LC3双荧光自噬体系观察骨肉瘤细胞中自噬流。免疫缺陷小鼠接种转染HSP90AA1 shRNA的骨肉瘤细胞建立皮下成瘤模型。采用TUNEL染色法和LC3染色法检测肿瘤组织中凋亡和自噬的水平。机制研究中,使用Western blot检测细胞通路相关蛋白Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR,JNK,p-JNK,p38和p-p38的表达水平。使用生物学预测软件和荧光素酶报告基因实验检测调控HSP90AA1的miRNA。实时定量PCR检测组织标本和细胞系中miRNA-495的表达水平。转染miRNA-495 mimic、miRNA-495 inhibitor和(或)HSP90AA1 shRNA后,通过划痕实验和Transwell实验检测骨肉瘤细胞侵袭和迁移水平;实时定量PCR和Western blot检测上皮间质转化相关分子E-cadherin,Vimentin,Snail1和ZEB1的表达水平。通过慢病毒感染建立过表达miR-495骨肉瘤细胞系。免疫缺陷小鼠尾静脉注射miR-495过表达骨肉瘤细胞建立肺转移模型。HE染色观察肺组织中转移瘤数量和大小。【结果】骨肉瘤化疗中常用的药物顺铂、阿霉素和氨甲喋呤均能提高骨肉瘤细胞中HSP90AA1的表达水平。化疗药物作用期间,过表达HSP90AA1显著降低了骨肉瘤细胞凋亡,同时提高了细胞增殖水平,表明骨肉瘤细胞出现化疗药物抵抗。在体内动物实验和体外细胞实验中,抑制HSP90AA1的表达后恢复了骨肉瘤对化疗药物的敏感性。并且,机制研究发现自噬参与到骨肉瘤细胞的化疗药物抵抗之中。HSP90AA1通过诱导自噬的发生,抑制了细胞凋亡,从而增加骨肉瘤细胞的耐药性。在骨肉瘤细胞化疗过程中,抑制HSP90AA1表达可以明显减少自噬对骨肉瘤细胞的保护作用。此外,HSP90AA1通过PI3K/Akt/mTOR细胞通路促进自噬的发生,而细胞凋亡作用则受到JNK/P38细胞通路的调节。荧光素酶报告基因实验和Western blot实验显示:HSP90AA1是miR-495的靶分子。我们首次发现在骨肉瘤组织标本和细胞系中miR-495的表达水平显著下调。体外实验中,过表达miR-495抑制骨肉瘤细胞侵袭和转移,伴随着Vimentin,Snail1 and ZEB1表达下降以及E-cadherin表达升高。抑制miR-495促进骨肉瘤细胞侵袭和转移,伴随着Vimentin,Snail1 and ZEB1表达提高以及E-cadherin表达下降。体内动物实验中,过表达miR-495对骨肉瘤细胞的肺转移有明显的抑制作用。此外,抑制HSP90AA1表达成功逆转了抑制miR-495对细胞侵袭和迁移的促进作用。与此同时,HSP90AA1过表达成功抵消了miR-495过表达对细胞侵袭和迁移的抑制作用。【结论】化疗药物可以诱导骨肉瘤细胞中HSP90AA1表达。HSP90AA1作为自噬的重要调节因子,在体内体外实验中均促进骨肉瘤细胞化疗药物耐药性的产生。HSP90AA1为改善骨肉瘤的治疗提供了新的靶点。我们首次证明,miR-495在骨肉瘤中作为肿瘤抑制因子,靶向调控HSP90AA1抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭。并且,其对骨肉瘤侵袭和迁移的抑制作用是通过抑制上皮间质转化实现的。miR-495也为骨肉瘤的治疗提供的新的靶点。
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骨肉瘤,化疗药物,获得性耐药,内在性

图 1 骨肉瘤耐药的发展[16]Figure 1 The question of when chemotherapy resistance emerges in osteosarcoma istill unanswered. One view is that osteosarcoma cells can change with therapy and becomcells that are resistant to agents already administered (A). Another view is thachemoresistant cells existed from the very beginning (B). After chemotherapy, sensitivcells are eliminated, leaving the resistant cells to proliferate.2、肿瘤中主要的耐药机制肿瘤对化疗药物的耐药性可以分为：内在性耐药和获得性耐药[17, 18]。内在性耐药指未接触化疗药物之前，已经存了对化疗药物的抵抗作用。获得性耐药指在接触化疗药物后，初始对化疗敏感的细胞由于药物作用产生基因突变或是激活细胞内药物代偿相关信号通路，最终产生了耐药作用[19]。肿瘤细胞可以通过多种不同的机制对一种或多种化疗药物产生耐药性[20-23]。根据药物种类以及细胞环境的不同，药物靶点突变，药物靶蛋白表达的上调或下调，药物清除率的下降以及 DNA 损伤修复等

BCL-2蛋白,治疗靶点,抗细胞凋亡,凋亡蛋白

图 2 DNA 损伤对耐药性的影响[17]2 The DNA damage induced by agents such as cisplatin cause cell cygive the cancer cell time to repair the damage, resulting in drug ral apoptosis can reduce the efficiency with which drug-induced DNcell death. Cytotoxic drugs frequently activate prosurvival adaptive activation of prosurvival signals, alterations in morphology (suesenchymal transition) and autophagy.凋亡多的证据显示，肿瘤标志性特征之一的抗细胞凋亡作用是造成化的原因，并且发现肿瘤细胞会对抗凋亡蛋白表现出更强的“亲和抗凋亡蛋白就成为新的治疗靶点。其中，，研究最为广泛的是BCL研究显示，过表达BCL-2可以促进白血病细胞和小鼠胸腺细胞对生耐药[35, 36]。BCL-2蛋白家族的其他成员也被证明广泛参与到化
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738

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