质子感知受体调控人髓核细胞凋亡机制研究

发布时间：2020-05-26 13:05

【摘要】：目的:1.探究酸性环境对人椎间盘髓核细胞凋亡的影响。2.探究人椎间盘髓核细胞中是否存在OGR1亚家族受体,酸性环境是否能激活人椎间盘髓核细胞中的OGR1亚家族受体。3.探究酸性环境调控人椎间盘髓核细胞凋亡的分子机制,为椎间盘退变的预防与治疗提供理论依据。方法:获取手术切除的人体椎间盘,仔细分离出其中的髓核组织,对其进行体外细胞培养,相差倒置显微镜下观察人椎间盘髓核细胞的形态。将体外培养的细胞利用瑞氏-吉姆萨、甲苯胺蓝、番红-O和II型胶原免疫细胞化学染色进行观察和鉴定,并将同步生长的P3代髓核细胞随机分为三组:对照组用普通培养基(pH值7.4)培养,酸性组用酸性培养基(pH值6.8)培养和抑制组用酸性培养基(pH值6.8)+Cucl_2(酸质子受体抑制剂)培养。三组髓核细胞用不同的培养基培养24小时后,激光共聚焦显微镜观察对照组和酸性组髓核细胞DAPI染色后细胞核的形态变化。流式细胞仪测定对照组和酸性组髓核细胞的凋亡率。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测三组髓核细胞OGR1亚家族受体(OGR1、G2A、TDAG8及GPR4)基因表达情况。蛋白质印迹法(Western Blot)检测三组髓核细胞OGR1、钙蛋白酶(Calpain)和钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin)蛋白表达情况。激光共聚焦显微镜观察酸性刺激对髓核细胞内Ca~(2+)水平的影响。酶联免疫吸附实验(Elisa)测定三组髓核细胞培养液中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表达情况。结果:相差倒置显微镜下观察人椎间盘髓核组织消化后获得的细胞为小球形,细胞核清楚而明亮,胞浆丰富,漂浮在细胞培养基中,有时也可以见到少数尚未消化完全而抱在一起的细胞团。原代髓核细胞贴壁时间较长,24小时后有少量细胞开始慢慢贴壁,7天后绝大部分细胞完成贴壁,贴壁后的细胞逐渐伸展变为短梭形或多角形,细胞核呈圆形较大,胞浆丰富,内含分泌小体。大约7天左右,细胞间开始有突起互相连接,细胞呈单层生长状态。2 3周后,细胞增长逐渐加速,出现非常活跃的增殖及融合,相差倒置显微镜下可以见到细胞铺满培养瓶底,增殖活跃处可出现细胞复层。与原代髓核细胞相比,传代后的髓核细胞贴壁时间明显缩短,约2 3小时,其增殖及融合速度也明显加快,大约7天后,培养瓶底铺满细胞。体外培养的细胞瑞氏-吉姆萨染色观察细胞呈短梭形或多角形,位于中央的细胞核为圆形或椭圆形,染成红紫色,胞浆丰富,染色较淡。细胞甲苯胺蓝、番红-O和II型胶原免疫细胞化学染色结果均为阳性,说明培养的细胞可以分泌糖胺聚糖、蛋白多糖和II型胶原,证实实验中体外培养的细胞为髓核类软骨细胞。激光共聚焦显微镜观察髓核细胞DAPI染色结果显示,镜下可以看到呈现蓝色荧光的细胞核。对照组髓核细胞的细胞核为圆形或椭圆形,形态完整,染色质均匀;而酸性组髓核细胞的细胞核形态不规则,出现核固缩,核内出现颗粒样物质。流式细胞仪测定的对照组和酸性组的髓核细胞凋亡率分别为1.03±0.30和37.14±2.14,两组间比较具有统计学差异(P0.05)。qRT-PCR结果显示,人椎间盘髓核细胞表达OGR1、G2A及GPR4mRNA,而TDAG8mRNA未见表达,并且酸性环境下,OGR1mRNA表达最为明显(P0.05);抑制组OGR1mRNA表达明显降低(P0.05),而G2A及GPR4mRNA未见明显变化(P0.05)。激光共聚焦显微镜观察髓核细胞内Ca~(2+)水平结果显示,在受到酸性条件刺激后,对照组和抑制组的髓核细胞内Ca~(2+)水平均有升高;对照组髓核细胞内的Ca~(2+)最高荧光强度为4095,而抑制组髓核细胞内的Ca~(2+)最高荧光强度为1536,可见酸性刺激可明显增加细胞内Ca~(2+)水平,加入抑制剂后,细胞内Ca~(2+)水平升高受到抑制。Western Blot结果显示,酸性环境下,人椎间盘髓核细胞表达OGR1、Calpain和Calcineurin;加入抑制剂后,OGR1、Calpain和Calcineurin的表达均受到抑制。Elisa结果显示,酸性环境可以抑制髓核细胞Bcl-2蛋白表达,促进Bax及Caspase-3蛋白表达(P0.05);而加入抑制剂后,可以促进髓核细胞Bcl-2蛋白表达,抑制Bax及Caspase-3蛋白表达(P0.05)。结论:1.酸性环境可以促进人椎间盘髓核细胞的凋亡。2.人椎间盘髓核细胞中存在OGR1亚家族受体,并且酸性环境可以激活人椎间盘髓核细胞中的OGR1受体。3.酸性环境下,人椎间盘髓核细胞中的OGR1受体被激活后,触发细胞内Ca~(2+)水平升高,激活Ca~(2+)敏感蛋白Calpain和Calcineurin,激活的Ca~(2+)敏感蛋白Calpain和Calcineurin进一步抑制Bcl-2蛋白,激活Bax和Caspase-3蛋白,导致细胞凋亡。
【图文】：

细胞核,II型胶原,番红,细胞

1.2.2 髓核细胞的染色观察及鉴定结果瑞氏-吉姆萨染色显示 P1 代髓核细胞呈短梭形或多角形，位于中央的细胞核为圆形或椭圆形，被染为红紫色，，胞浆丰富，染色较淡(图1.3)；甲苯胺蓝染色显示细胞核被染为蓝色，胞浆丰富，染色较淡，说明细胞可以合成糖胺聚糖(图1.4)；番红-O染色显示细胞核被染为红色，胞浆丰富，染色较淡，说明细胞可以合成蛋白多糖 (图1.5)；II型胶原免疫细胞化学染色显示细胞核基本不被染色，胞浆丰富呈棕黄色，说明细胞能合成II型胶原，苏木素复染后细胞核被染为蓝色，胞浆仍保持棕黄色(图1.6)。图1.5 番红-O染色(×200) 图1.6 II型胶原免疫细胞化学染色(×200 )图 1.3 瑞氏-吉姆萨蓝染色(×200) 图 1.4 甲苯胺蓝染色(×200 )图 1.1 接种 7 天后的细胞图 1.2 接种 21 天后的细胞

甲苯胺蓝染色

染色较淡(图1.3)；甲苯胺蓝染色显示细胞核被染为蓝色，胞浆丰富，染色较淡，说明细胞可以合成糖胺聚糖(图1.4)；番红-O染色显示细胞核被染为红色，胞浆丰富，染色较淡，说明细胞可以合成蛋白多糖 (图1.5)；II型胶原免疫细胞化学染色显示细胞核基本不被染色，胞浆丰富呈棕黄色，说明细胞能合成II型胶原，苏木素复染后细胞核被染为蓝色，胞浆仍保持棕黄色(图1.6)。图1.5 番红-O染色(×200) 图1.6 II型胶原免疫细胞化学染色(×200 )图 1.3 瑞氏-吉姆萨蓝染色(×200) 图 1.4 甲苯胺蓝染色(×200 )图 1.1 接种 7 天后的细胞图 1.2 接种 21 天后的细胞
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R681.5

【参考文献】