microRNA-135b表达沉默Ppm1e激活AMPK信号通路抑制人骨肉瘤细胞增殖

发布时间：2020-06-08 12:09

【摘要】：研究背景:骨肉瘤(OS)是世界各地儿童和青少年有关癌症死亡的主要原因之一。骨肉瘤的诊断和临床治疗取得了显著的进步,五年的总体生存率已提高到了70%以上。然而,对于那些患有晚期,恶性和/或复发性骨肉瘤的患者,预后仍然很差。因此,本研究组一直致力于了解骨肉瘤发生发展的病理机制,并开发新型抗骨肉瘤药物。微小RNA(micro RNA)属于一组小编码调控RNA分子,其在OS中的作用越来越得到重视。研究目标:明确micro RNA-135b(miR-135b)抑制人骨肉瘤细胞的增殖作用及其分子机制,为发现一种新颖、有效的靶向疗法来治疗这种异质复杂的疾病提供分子生物学的依据。研究方法和内容:1.运用实时定量PCR(qRT-PCR),蛋白质免疫印迹实验(Western blotting)等方法研究人骨肉瘤组织及MG-63,U2OS人骨肉瘤细胞中miR-135b-5p、Ppm1e RNA的表达水平和Ppm1e、p-AMPKα1蛋白的的表达水平;2.转染慢病毒包裹miR-135b-5p表达载体,在MG-63,U2OS人骨肉瘤细胞中过表达miR-135b-5p,运用PCR,蛋白质免疫印迹观察转染细胞的Ppm1e RNA及蛋白和p-AMPKα1蛋白的表达水平变化;3.转染慢病毒包裹miR-135b-5p表达载体,在MG-63,U2OS人骨肉瘤细胞中过表达miR-135b-5p,运用细胞计数试剂盒,细胞集落实验,Brd U ELISA观察转染细胞增殖变化;4.转染慢病毒包裹Ppm1e shRNA敲减Ppm1e后,在MG-63人骨肉瘤细胞中,运用细胞计数试剂盒,细胞集落实验,Brd U ELISA检测观察细胞增殖的变化;5.通过转染慢病毒包裹的AMPKα1 shRNA或AMPKα1显性负性遗传突变(T172A)阻断AMPK活化,在MG-63人骨肉瘤细胞中观察它们对miR-135b-5p诱导的抗骨肉瘤细胞活性变化;6.将过表达Ppm1e shRNA、Vec-miR-135b的稳转U2OS人骨肉瘤细胞和对照的U2OS细胞建立裸鼠荷瘤模型,观察上述肿瘤的生长情况,并运用实时定量PCR,蛋白质免疫印迹和免疫组化检测miR-135b-5p Ppm1e RNA和Ppm1e p-AMPKα1蛋白的表达水平变化。研究结果:1.与周围正常骨组织相比,miR-135b-5p和p-AMPKα1在人骨肉瘤组织中呈低表达,而Ppm1e m RNA和蛋白高表达;2.在MG-63,U2OS人骨肉瘤细胞中转染慢病毒包裹的miR-135b-5p,miR-135b-5p表达显著上调,并且显著抑制Ppm1e表达并诱导AMPK磷酸化水平显著上升;3.在MG-63,U2OS人骨肉瘤细胞中过表达miR-135b-5p显著抑制骨肉瘤细胞的增殖;4.在MG-63人骨肉瘤细胞中shRNA方法敲减Ppm1e后,p-AMPKα1水平增加,肿瘤细胞增殖受到抑制;5.在MG-63人骨肉瘤细胞中,利用AMPKα1 shRNA或AMPKα1显性负性遗传突变(T172A)阻断AMPK后几乎逆转了miR-135b-5p诱导的AMPK的活化的抗骨肉瘤细胞的活性的作用;6.将过表达Ppm1e shRNA、Vec-miR-135b的稳转U2OS人骨肉瘤细胞和对照的U2OS细胞建立裸鼠荷瘤模型相比,表达Ppm1e shRNA、Vec-miR-135b的肿瘤生长显著受到抑制,Ppm1e RNA和蛋白显著下调,p-AMPKα1蛋白的表达水平显著上调。研究结论:miR-135b-5p激活Ppm1e-AMPK信号通路抑制人骨肉瘤细胞增殖;
【图文】：

人骨肉瘤组织中低表达 AMPK 去磷酸化酶 Ppm1e 而达到激活新的研究表明，miR-135b-5p 是特 miR-135b-5p 的靶基因[13,14]。因此，表达水平。如图 1 所示，与周围正常骨 miR-135b-5p 表达水平显著下调（“肿水平仅为周围正常组织的 30％左右（织中低表达。图 1

在人骨肉瘤组织中高表达。与周围or”）组织内 Ppm1e mRNA 的表达10）。P<0.01 (和正常骨组织比较)。肉瘤组织中高表达肉瘤组织中 miR-135b-5p 低表达我们运用 Western blotting（WB）示，和 mRNA 表达情况类似，，Ppm 10 组病人标本的结果显示，OS 组3）。图 3
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R738.1

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本文编号：2703064