关节软骨和软骨下骨在骨关节炎中相互作用机制的初步研究

发布时间：2020-06-13 11:07

【摘要】：【目的】骨性关节炎(OA)的发生发展常伴有软骨退变和软骨下骨的骨质改变,软骨细胞和成骨细胞在其中起着重要的调节作用,本研究旨在探讨体外软骨细胞和成骨细胞相互作用的机制、不同锻炼强度在骨质疏松和关节炎模型中关节软骨和软骨下骨病理改变的发生和发展机制。【方法】(1)在体外,分别从出生24h内和4w SD大鼠体内通过酶消化法的方法获得成骨细胞和软骨细胞,使用软骨细胞的条件培养基培养成骨细胞后行碱性磷酸酶的染色,使用成骨细胞条件培养基间接共培养IL-1β诱导的大鼠软骨细胞,免疫蛋白印迹电泳Western Bloting检测其相关的炎症指标环氧酶COX-2、基质金属蛋白酶MMP13和蛋白多糖酶ADAMTS-5等,Western Bloting初步检测OPG/RANK/RANKL、MAPK、NF-κB等通路蛋白的激活。(2)在体内,选取12w雌性SD大鼠60只行双侧卵巢切除术,术后再次行膝关节前交叉韧带切除术,术后将其分为五组:前交叉韧带切除术的假手术为shamFree组,手术后无干预为Free组,手术后在水平跑台低速跑步锻炼(12m/min)为L-TW组,手术后在水平跑台高速跑步锻炼(18m/min)为H-TW组,手术后皮下注射双磷酸盐[30μg/(kg·d)]为anti-OP组。在4w和8w时,ELISA检测大鼠的血尿样上清的CTX-Ⅰ、CTX-Ⅱ和OPG蛋白,micro-CT仪器扫描大鼠的将膝关节,并将股骨行HE、甲苯胺蓝、番红固绿和Ⅰ/Ⅱ/Ⅹ型胶原等免疫组化的染色以及骨关节炎软骨病理OARSI评分。【结果】(1)在体外成功获得大鼠的软骨细胞和成骨细胞,并保持细胞表型特性。在体外软骨细胞和成骨细胞的间接共培养体系中,软骨细胞条件培养基可能促进成骨细胞碱性磷酸酶的合成,而成骨细胞条件培养基可以上调炎性软骨细胞的炎性指标COX-2和蛋白多糖酶ADAMTS-5的表达,下调基质金属蛋白酶MMP13的表达。同时成骨细胞条件培养基可以激活和上调NF-ΚB/P65、MAPK-P38/JNK/ERK等信号通路蛋白。(2)通过卵巢切除可以造成大鼠骨质疏松,前交叉韧带切除后膝关节不稳,在4w时,CTX-Ⅰ在H-TW组和L-TW组的血液中明显增加,同时H-TW组血液中OPG明显升高。在8w时,CTX-Ⅱ在H-TW组明显减少,血液中OPG在H-TW组和anti-OP组明显增加而在尿液中明显减少,且尿液中CTX-Ⅰ的浓度明显升高。在4w时,H-TW组和anti-OP组的股骨下端的骨量明显增加,至8w时双磷酸盐的作用减弱,而在8w时,两组在软骨下骨的成骨效应明显。anti-OP组与L-TW组、H-TW组相比,细胞形态和关节表面无明显的变化,甲苯胺蓝染色着色加深,关节软骨厚度基本无明显变化。而在L-TW组和H-TW组中,关节软骨层明显减少,表层软骨细胞的形态改变,陷凹消失,软骨下骨的活动性增强,潮线发生改变,尤其是在H-TW组,关节表面粗糙,软骨细胞减少并伴有纤维化,甲苯胺蓝着色不均匀。在糖胺聚糖和Ⅱ/Ⅹ型胶原的染色中,低速跑步的L-TW组染色较为明显,而高强度锻炼的H-TW组着色效果较浅。OARSI评分中,H-TW组与Free组有显著的差异,p0.05。【结论】(1)在体外软骨细胞和成骨细胞的间接共培养体系中,软骨细胞和成骨细胞的表型均发生变化,软骨细胞条件培养基可能促进成骨细胞成骨,而成骨细胞培养基可以改变炎性软骨细胞的炎性指标或基质酶的表达,MAPK、NF-ΚB/P65信号通路在其中可能起着至关重要的作用。(2)绝经大鼠前交叉韧带切除后,早期的高强度的高速跑步锻炼和补充双磷酸盐抗骨质疏松可以增强股骨下端骨质,逆转卵巢切除术后所致的骨质疏松,后期双磷酸盐的作用减弱,同时,还可以明显增加膝关节软骨下骨的骨量,增强成骨效果。绝经大鼠前交叉韧带切除术后8w时,高强度的跑步锻炼可以明显加速关节炎的进程,低强度的跑步锻炼明显抑制或延缓关节软骨的退变,补充双磷酸盐并不会加速关节软骨退变。
【图文】：

甲苯胺蓝,炎症,软骨细胞,细胞

取材获得的软骨细胞和 IL-1β处理后炎症化细胞及其甲苯胺蓝的染色（a）为 4w SD 大鼠关节软骨细胞（RAC）原代细胞的光镜下细胞形态；（b）为未经任何处理的 RAC 细胞的甲苯胺蓝的染色；（c）为经过 IL-1β处理后的“炎症化”的软骨细

茜素红,成骨细胞,油红,乳鼠

取材获得的成骨细胞及其茜素红、油红 O 的染色（a）为 SD 乳鼠颅骨酶消化法获得的原代细胞的光镜下细胞形态（x100）；（b）为成骨细胞的茜素红染色（x200）下的钙结节的形成和着色；（c）为大鼠成骨细胞的油红 O
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R684.3

【参考文献】