aFGF磺化壳寡糖温敏凝胶在脊髓损伤修复中的应用研究

发布时间：2020-06-26 16:01

【摘要】：目的:aFGF的神经保护作用使其具有应用于中枢神经损伤修复的潜能。但其分子量大,生物半衰期短,在体内消除迅速,而神经损伤修复是一个相对漫长的过程,制备一种体内缓慢释放aFGF的新材料为临床所急需。本实验室前期合成的磺化壳寡糖(SCOS)具有类肝素的作用,可替代肝素作为aFGF的活性保护剂,同时SCOS亦是一种生物活性基质材料,可用于水凝胶制备。为此,本研究采用SCOS为载药材料,辅以壳聚糖和泊洛沙姆,制备一种负载aFGF温度敏感型水凝胶,并开展其对脊髓损伤修复治疗药效学研究,以拓展aFGF在中枢神经损伤修复治疗中的应用。方法:(1)建立连二硫酸钠(Na_2S_2O_4)诱导的RSC96细胞缺氧-复氧损伤模型,采用MTT法检测细胞活力,以及测定乳酸脱氢酶(LDH)的量来确定RSC96的损伤程度;然后根据乳酸脱氢酶(LDH)的释放量,探究磺化壳寡糖、aFGF以及两者联用对损伤RSC96细胞的保护作用,推测磺化壳寡糖对aFGF的活性保护作用;(2)在明确SCOS可提升aFGF神经细胞保护作用的基础上,利用泊洛沙姆特殊的可逆温敏特性,制备了aFGF温敏水凝胶,通过扫描电镜观察水凝胶内部结构;酶联免疫吸附法(ELISA)测定aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶中aFGF的释放情况;利用小鼠进行体内生物相容性实验,观察aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶的组织相容性。(3)建立大鼠脊髓损伤模型,通过行为学(BBB,斜板,神经电生理,步态分析)和形态学(HE,Nissl染色)观察大鼠后肢运动恢复及脊髓组织结构变化情况;利用Western Blotting、免疫组化和免疫荧光技术研究大鼠运动功能恢复相关蛋白变化的情况;利用透射电镜观察髓鞘的形态变化;用血管造影CT成像技术检测损伤部位微血管再生情况;探索aFGF水凝胶对脊髓损伤修复的作用机理。结果:(1)aFGF与磺化壳寡糖联用效果优于单独使用aFGF,与肝素效果基本相同,表明SCOS能有效的提升aFGF对Na_2S_2O_4诱导缺氧损伤RSC96细胞的保护作用;(2)成功建立了一个在4℃为液体,32℃以上为胶凝状态的温敏凝胶体系,扫描电镜发现此凝胶体系为疏松多孔,呈层状分布的三维结构。ELISA结果发现,aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶对aFGF具有缓慢释放的作用,累计释放率达到80%左右。生物相容性结果显示,aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶在体内超过21 d没有完全降解,能保证aFGF在体内的停留时间,持续发挥药效;给药45 d后,没有出现炎症反应,皮下周围组织形态正常,小鼠活动正常,表明aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶具有良好的生物相容性。(3)大鼠脊髓损伤修复研究中发现,给与aFGF治疗后,模型动物运动能力显著恢复(P0.05),而aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶组的效果更优于单独注射aFGF组。形态学显示aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶组的脊髓结构较完整,尼氏小体数量增多。GFAP结果表明aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶组给药28 d后能显著降低星形胶质细胞的活化程度,减少胶质瘢痕的形成。SYN结果表明aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶组能显著促进SYN的表达,促进轴突的再生和突触功能的恢复。髓鞘电镜观察结果发现aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶组能够促进髓鞘数量和厚度以及紧密程度的增加。CD31和VEGF以及血管CT成像结果表明aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶组能够在早期促进血管的生成,后期趋于稳定,为神经元的修复与再生提供良好的微环境。结论:(1)磺化壳寡糖SCOS能有效地提升aFGF的生物学活性,同时具有一定缓释aFGF作用。(2)成功制备了一种具有良好生物相容性的aFGF温敏水凝胶,与aFGF单独用药相比,aFGF磺化壳寡糖温敏水凝胶对神经损伤具有更好的修复作用,有效的提升aFGF的生物学活性,并通过单次给药,长效释药的方式增强aFGF的作用效果,使患者免受多次给药的痛苦。
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TQ427.26;R651.2;R318.08
【图文】：

细胞损伤,程度,暨南大学,双因素方差分析

暨南大学硕士学位论文2.5 数据分析数据以均数±标准误差（Mean±SEM）表示，用 GraphpadPrism6.0 软件作图并进行统计学分析，采用单因素和双因素方差分析对组间进行差异性比较， P<0.05 为具有统计学差异。3. 实验结果3.1 Na2S2O4对 RSC96 细胞损伤浓度的摸索通过倒置显微镜，细胞存活率，LDH 释放率来探索 Na2S2O4的损伤浓度。A B

损伤后,细胞,细胞存活率,保护作用

暨南大学硕士学位论文和 B 对比发现，Na2S2O4损伤后，细胞明显萎缩，突起变细变短，部分细胞坏死。MTT 结果显示，随着浓度的升高，细胞存活率具有明显的差异性（P < 0.01），在 6-8 mm/L 时细胞存活率为 60示，随着浓度的升高，LDH 的释放率逐渐增加，在 6-10 mm/L ）。结合 MTT 结果与 LDH 结果，最终选择 8 mmol/LNa2S2O4为究。损伤细胞的修复作用发现 aFGF 对神经元具有保护作用，为了探索最佳浓度，将不同2O4损伤后的 RSC96 细胞，观察 aFGF 的损伤修复与保护作用，

【参考文献】